FAQ : ORIGENE（ORG）社 CRISPR/Cas9ゲノム編集用ガイドベクターについて

はい。NGGは20bp標的特異的配列の3' 末端直後に配置します。

20bp標的特異的配列はNGG（PAM）の前に来ます。20bp標的配列のシード領域（12bp PAM近位）をBLASTにかけ、この配列がゲノムに対してユニークであり、特異性を示すことを確認してください。シード領域（5'-NNNNNNNNNNNN-NGG-3'）は対象とするゲノムに対して特異的です。シード領域に続いてNGGやNAGをもつ配列であっても、シード領域に3bp以下のミスマッチをもつ配列は使用できません。

標的配列をデザインする際、配列をBLASTにかけます。もし、オフターゲット配列がPAM（NGG）をもたない場合、その配列はCRISPR/Cas9に標的されません。また、標的配列にはオフターゲット配列と比べて3'末端 8-14 塩基にミスマッチをもつものを選択します。これにより、オフターゲット作用のリスクが格段に下がります。医薬品開発目的の場合、一本鎖切断を行うCas9ニッカーゼタイプの利用もご検討ください。

gRNAの性質上、予測不可能であることを考慮し、少なくとも1つのターゲティング配列が機能することを目指して2つ以上のgRNAターゲティング配列をデザインすることをおすすめします。

標的遺伝子が内在性タンパク質と区別可能なタンパク質をコードする場合、 ウェスタンブロット法が利用できます。または、プライマーの一方をドナー配列内に設計し他方のプライマーをドナー配列の下流に設計して「ジャンクションPCR」を行い、ドナー配列を検出することもできます。

Cas9はゲノム上の標的配列の3' 末端から3塩基離れた部分を切断します。

遺伝子ノックアウトマウスやショウジョウバエといった他の生物種においてゲノム編集を行う場合、gRNAとCas9 mRNAを細胞にマイクロインジェクションする場合があるためです。

ご利用の細胞に適したトランスフェクション試薬を選択することができるかと思います。トランスフェクションの困難な細胞の場合、エレクトロポレーションを利用する研究者も多くいらっしゃいます。pCas-Guide-EF1a-GFP(品番：GE100018)のGFP発現をトランスフェクション効率のモニターやトランスフェクトされたGFP陽性細胞の選別用に利用することもできます。

pCas-Guide-EF1a-GFP(品番：GE100018)からはGFPも発現するため、GFP発現がみられる細胞をもとにトランスフェクトされた細胞を選別することができます。ORIGENE社では pCas-Guide-EF1a-CD4ベクターもご用意しており、CD4抗体ビーズを用いてトランスフェクトされた細胞の濃縮を行うことができます

ドナーの鋳型DNAが存在しない場合、二本鎖切断はNHEJによる修復を受け、予期できない挿入欠損が生じるため、フレームシフトを生ずる欠損／挿入をスクリーニングする必要があります。ドナーDNAプラスミドを用いると、希望する挿入／欠損／変異を入れることができます。

CRISPR-CasにおけるHDR介在性修復では、600-1000 bpの相同左腕または右腕が適当であると思います。

ひとつのpre-mRNAがスプライシングを受けて異なるスプライシングバリアントの遺伝子が生じます。ORIGENE社において全てのスプライシングバリアントをノックアウトできるよう標的配列をデザインする際には、最も長鎖のスプライシングバリアントの開始コドン（ATG）周辺に標的配列をデザインします。ドナーベクターの相同左腕の3'末端は開始コドン（ATG）のすぐ上流となります。相同組換えにより、ゲノム上の最長鎖スプライシングバリアントのコード領域の一部がGFP-Puroカセットと置換されます。GFP-Puro機能をもつカセットの3'末端には転写終止シグナルがあり、残りの標的遺伝子は転写されません。

各細胞コロニーを単離します。

無作為な組込みを回避するため、ドナーテンプレートDNAを開環しないことが好ましいです。

単一細胞コロニーを単離し、遺伝子ノックアウトやタグ付の場合はウェスタンブロットを、変異の場合はゲノムPCRや配列決定を行います。

遺伝子ノックアウトの場合、ウェスタンブロットを行って確認することができます。ゲノムPCRを行ってゲノムへの組込みを確認することもできます。変異の場合、ゲノム配列を増幅して配列決定します。遺伝子ノックアウトを行う場合、ドナーテンプレートDNA内の選択マーカーを利用することもできます。必要であれば、ゲノムへの特定変異導入や他のアプリケーション用に各細胞コロニーを単離することもできます。

NHEJ修復は非分裂細胞でも機能しますがHDRは活性をもちません。ドナーテンプレートDNAを使用せず、CRISPR-Cas9システムを用いて遺伝子を破壊することはできます。

CRISPR-Cas9による二本鎖切断は非常に効率的です。もしCRISPR-Cas9ベクターのみを使用して挿入欠損を導入する場合でトランスフェクション効率が高い場合、より二対立遺伝子ノックアウトが生じます。ドナーDNA存在下では、これが相同組換えの限定要因となるため、単一対立遺伝子ノックアウトが生じた細胞と二対立遺伝子ノックアウトが生じた細胞がみられます。

もし単一細胞コロニーを単離した場合、いくつかの細胞ではひとつの対立遺伝子においてのみ遺伝子ノックアウトが生じ、いくつかの細胞では両方の対立遺伝子において遺伝子ノックアウトが生ずる可能性があります。もし、二対立遺伝子ノックアウトを期待している場合で単一対立遺伝子ノックアウトのみが生じた場合、ブラストサイジンやネオマイシン耐性マーカーといった異なる哺乳類の選択マーカーをもった異なるドナーベクターをご利用頂くこともできます。ORIGENE社では何れの機能カセットもご用意しています。2番目の対立遺伝子を標的するため、新しいドナーベクターを用いてノックアウト工程を再度行います（一方の対立遺伝子は既にGFP-Puroカセットと置換されているため）。または、編集した細胞からCreを用いてPuroカセットを取り出し、ノックアウトキットの同一ドナーベクターを用いてノックアウト工程を再度行い、2番目の対立遺伝子を標的します。

Cas9抗体もご用意しています（品番：TA190309）。ORIGENE社のCRISPR-Cas9ベクターにはC末端Myc-DDKタグがついています。DDKはSIGMA社のFlag Rと同一のエピトープです。ORIGENE社の抗DDK抗体（品番：TA50011-100）をお試しください。

pCas-Scramble（品番：GE100003）またはpCas-Scramble-EF1a-GFP（品番： GE100021）といったスクランブルコントロールをご利用ください。

両方お試し頂けます。mRNA（gRNAとCas9 mRNA）またはプラスミドDNA（標的配列をクローンしたpCas-Guide）を接合体またはES細胞にインジェクションします。

CRISPR-Cas9システムを使用してマルチプレックスを行うことができます。複数のガイドRNAを使用細胞あるいは動物モデルに同時導入（またはインジェクション）することで複数の遺伝子破壊またはゲノム編集が得られます。ただし、トランスフェクション効率が限定要因になる可能性があります。

スクリーニング目的や短期的には、Cas9がゲノムに2週間組込まれても細胞に影響を及ぼしません。Clontech社より、トランスダクション後にレンチウイルスベクターが組込まれない非組込み型レンチパッケージングキットも販売されています。

可能です。ただし、20塩基の標的配列の後にNGG配列が必要です。

細胞株や標的配列によって、効果が異なります。

もしドナー構築の蛍光タンパク質が哺乳類の発現プロモータ−をもたない場合（例えば相同左腕がプロモーターを含まない場合）、蛍光細胞を識別することができます（トランスフェクションされた細胞内でのみドナーDNAがわかります）。単一細胞コロニーを抽出する必要がない場合もあります。もしドナー構築の蛍光タンパク質が哺乳類の発現プロモータをもつ場合、トランスフェクションされた遺伝子を数回継代し、ドナー構築を含む細胞を希釈する必要があります。

一般に、CRISPR-Cas9によるゲノム編集効率はTALENと同等またはそれ以上と考えられています。さらに、CRISPR-Cas9はほかのゲノム編集技術比べて非常にシンプルかつ簡単に利用できます。CRISPR-Cas9ではRNAを利用するのに対し、TALENシステムでは新規DNA配列ごとにこれを認識するタンパク質を作成しなければならない可能性があります。

5'-ACGATACAAGGCTGTTAGAGAG-3'

検証データはこちらよりダウンロード可能ですので、ご参照ください。

5' -GCACTACCAGAGCTAACTCA- 3'

はい、カスタム構築サービスも承ります。お問合せください。

pLenti vector は第3世代のレンチウイルスベクターであり、双方のLTR領域が切断された 現時点で最も安全だと考えられているレンチウイルスベクターです。 ただし、pLenti vectorをご利用の際には、事前にご所属の機関の生物学的安全性部門にお問い合わせいただき、許可を得ると同時に機関特定の指導を得てください。レンチウイルスの取扱いは、全てBL2/(+)条件下で行ってください。全ての汚染除去ステップにおいて70%エタノール／1% SDSをご利用ください。レンチウイルス調製、感染細胞の取扱い、トランスフェクション試薬とレンチウイルスDNAの混合物の取扱いといった全行程において、手袋をご使用ください。

* 日本国内では、P2レベルの機関承認実験です。

第3世代のレンチウイルスベクターは第2世代ベクターより安全面で優れています。第3世代のパッケージングシステムではgagとpolをひとつのベクターから、revを他のベクターから発現させます。第3世代のパッケージングシステムではtat（転写のトランス活性化因子）を発現させません。

レンチウイルス産生には通常HEK293T細胞が 使用されます。コスモ・バイオではさまざまな細胞を扱っておりますが、Cell Biolab社の293LTV Cell Line(品番：LTV-100)は、レンチウイルス用に選択されたセルラインです。293T cell line に比べ、高レンチウイルス収率や培養プレートへの安定結合、より早い増殖能を持つといった特長があり、おすすめです。

ORIGENE社のpLentiベクターは導入遺伝子発現を目的とした一過性トランスフェクションにも使用できます。ただし、一般にはトランスフェクション効率が低いことからタンパク質産生量が低くなります。

レンチウイルスはレトロウイルスの亜型です。レンチウイルスと標準的なレトロウイルスとの主な違いを特に実験的な観点からいうと、レンチウイルスは非分化細胞と活発な分裂細胞の何れにも感染可能であるのに対し、標準型のレトロウイルスは有糸分裂細胞にのみ感染可能です。レンチウイルスと標準型レトロウイルスの何れもgag, pol, env遺伝子をパッケージングに利用します。ただし、これらのタンパク質はレトロウイルスとレンチウイルスで異なるイソ型を使用するため、異なるパッケージングベクターを使用した場合、効率的なパッケージングが行われない可能性があります。

第2世代のパッケージングシステムも理論的にはORG社の第3世代pLentiベクターに使用できるはずですが、実験的検証は行っていません。pLenti-vectorには、ORIGENE社の 第3世代パッケージングキット（品番：TR300022）をご利用ください。

M13 forward primer: 5' CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3'をご利用ください。