タンパク質バイオマーカーの検出に使用される ELISA キットに関して、PBL Assay Science 社において、何度も繰り返し観察されているのは、すべてのアッセイが同じように作成されているわけではないということです。30年以上にわたるELISAの設計および製造の経験、並びにお客様のための第三者のELISAの適格性確認および実施の経験から、アッセイの設計、性能、特性評価に関して以下のような共通の懸念事項を特定しました:
- 対象となる分析対象の生物学的変動性を十分に考慮していない設計
たとえば、一部の分析対象は異なるアイソフォームとして、または分子複合体の一部として存在しますが、多くのアッセイではこれを検出できるように最適化されていません。 - 定量化における感度の欠如
理想的には、ELISA は、健常なドナーのサンプル中の低濃度の分析対象物を正確に定量し、疾患状態のサンプルと比較するためのベースラインを提供するように設計される必要があります。 - 実際のサンプルによく見られる干渉物質の存在下では定量が不正確
アッセイがこれらの因子を考慮して最適化されていない場合、健常サンプルと疾患サンプルの両方に含まれる生物学的化合物によってシグナルが人為的に低下する可能性があります。 - アッセイの仕様が不完全
ELISA の仕様では、アッセイ範囲と定量下限値 (LLOQ)、つまり分析対象物を信頼性を持って定量できる最低濃度の両方を詳細に規定する必要があります。バイオ分析アッセイのバリデーションに関する現在の ICH M10 ガイダンスによれば、LLOQ は、検量線の最低点以上でなければなりません。一部のサプライヤーでは、信頼性が高く一貫したパフォーマンスを示す方法でアッセイを適格化いない場合が見受けられます。また、多くの市販品では LLOQ を指定していないため、データの解釈に一貫性が無い場合があります。
以下は、PBL Assay Science社 が ELISA 製品の設計で取り組んだアッセイの課題の 4 つの例です。
VeriKine-HS ヒト IL-15 ELISA キット (品番： 41702)
ほとんどの ELISA は遊離している IL-15 または大腸菌発現 IL-15 のみを測定しますが、PBL は遊離 IL-15 と IL-15/IL-15Rα 複合体 (ヒトの血液中に見られる主な形態) の両方を検出できるように IL-15 キットを設計しました。このキットは、健常ドナーの血清および血漿中の内因性のトータル IL-15 および IL-15/IL-15Rα 複合体を検出するように設計されています。検査した健常ドナーの血清サンプルの 100% で、LLOQ を超える定量可能な IL-15 が検出されました。
図1.IL-15/IL15Ra複合体のスタンダードの検出。
IL15/IL15Ra のスタンダードは検出が不十分 (競合他社 B) か、まったく検出されません (競合他社 A および C)。
VeriKine-HS ヒト IFN-アルファALL-サブタイプ ELISA キット (品番：41115 および #41135)
ヒト IFN-α タンパク質のサブタイプが 12 種類あることは認識されていますが、市販されているほとんどのアッセイでは、健常サンプルと疾患サンプルのサブタイプの全範囲を検出できず、不正確な定量化につながります。PBL Assay Bioscience社 のELISAキットは、すべてのヒト IFN-α サブタイプを検出するように設計されており、偽陽性および偽陰性の結果を最小限に抑えるために、さまざまな疾患状態の血清サンプルでテストされています。この製品の高い感度（他の ELISA の 10 倍）は、ヒトのサンプルによく見られる低レベルのインターフェロンを区別するのに特に役立ちます。
図2. センダイウイルスにおける内因性インターフェロンアルファのレベルの経時的変化
VeriKine-HS ヒト IL-22 ELISA キット (品番： 41701)
多くの ELISA では、IL-22 結合タンパク質 (IL-22BP) の干渉により、生物学的サンプル中の遊離 IL-22 を正確に測定することが困難であり、健常サンプルや疾患サンプルに通常存在する低濃度の IL-22 を測定できないものが多くあります。PBL Assay Science社で は、低濃度の遊離 IL-22 を効果的に定量化し、健常サンプルや疾患サンプルの両方で正確な測定を保証する ELISA を設計しました。
* 競合他社 A は ELISA の「感度」を 5.8 pg/mL と記載しており、これを検出下限値 (LLOD) と解釈します。 LLOQ が提供されませんでした。
表1. PBLと競合ELISAキットの比較
VeriKine-HS ヒト IFN-β ELISA キット (品番：41415 および 品番：41435)
ほとんどの ELISA では、健常サンプルや疾患サンプルに存在する低レベルの IFN-beta は測定されません。 さらに、実際のサンプルによく存在する受容体成分である sIFNAR2 に結合した IFN-beta をアッセイで測定しない場合、ELISA の結果が人為的に低下する可能性があります。PBL Assay Scienceでは、低 pg/ml レベルおよび sIFNAR2 存在下で内因性インターフェロンを正確に定量化するために ELISA を設計しました。このアッセイは、大腸菌および CHO 細胞で発現したtherapeutic IFN-β 分子を定量化します。 自己免疫疾患血清での使用および商標登録された IFN-β 治療薬の定量化について、CRO によって検証されています。
図3. PBL のアッセイは血清サンプルで一貫して機能し、sIFNAR2 の存在による影響を受けません。
Contributed by Alok Pandey, Ph.D., VP Biomarker & Translational Science, PBL Assay Science
