Biotium（BTI）社　免疫蛍光染色　プロトコル

IFプロトコールには多くのバリエーションがあり、ターゲットやアプリケーションによってステップを最適化する必要がある場合があります。エピトープによっては、検出のために特定の固定条件が必要な場合があります。ここでご紹介するプロトコルは、Dish内の付着細胞または、カバーガラス上で増殖した細胞を染色するための基本的なプロトコルです。

• 商品情報：Paraformaldehyde, 4% in PBS, Ready-to-Use Fixative 電子顕微鏡グレードのパラホルムアルデヒド
• 商品情報：EverBrite™ Mounting Medium 退色しにくい封入剤
• 商品情報：CoverGrip™ カバーガラス シーリング剤 マニキュア不要・耐久性に優れたシールを形成

• PBSまたはHBSS（Ca^{2 +} / Mg^{2 +} を含むバッファーが付着細胞に最適な場合がございます。）
• 4%パラホルムアルデヒド含有PBS または、-20℃で冷やしたメタノール
• 1×リン酸バッファー(Ca^{2 +} / Mg^{2 +} フリー)
• PBS + 2％フィッシュゼラチン+ 0.1％Triton®X-100
• 一次抗体
• 二次抗体(ラベル済みの一次抗体の場合は必要ありません。)
• 退色防止封入剤(品番：23001など)
• カバーガラス

1. PBSまたはHBSSで細胞を2回リンスし、細胞培養液を除去します。洗浄液の量は、細胞培養液の量と同じにしてください（推奨：96ウェルプレートの1ウェルあたり100µLを使用）。細胞の種類によっては、細胞の丸みや剥離を防ぐために、Ca^{2 +} / Mg^{2 +} を含むバッファーが必要な場合があります。固着した細胞は、HBSS+ Ca^{2 +} / Mg^{2 +} で固定することをお勧めします。
2. 細胞の固定。
   通常、4％パラホルムアルデヒド/PBSを使用し、室温で20分間固定する。または、あらかじめ-20℃に冷却したメタノールで5〜10分間固定します。
   【注意】一次抗体の供給元が提供する情報を確認し、特定の固定方法が推奨されているかを確認してください。最適な固定条件が不明な場合、特定の抗体や標的エピトープに対して異なる固定方法をテストする必要がある場合があります。
   【注意】メタノール固定はファロイジン染色に適していません。
3. PBSで3回リンスし、固定液の残りを除去します。
   【注意】固定後の細胞はPBS中で数週間保存することが可能です。バッファーの蒸発を防ぐため、サンプルは密閉して保管するか、加湿器に入れて保管してください。
4. PBS + 2%フィッシュゼラチン + 0.1%Triton® X-100での細胞のブロックおよび透過します。
   オプション：この時点で、サンプルを4℃で数週間保存することができます。バッファーの蒸発を防ぐため、サンプルは十分に密閉するか、加湿ボックスで保管します。
   【注意】一部の高電荷蛍光色素を使用する場合、TrueBlack® IF Background Suppressor System(品番：23012)などの特殊なブロッキングバッファーがバックグラウンドを低減する場合があります。
5. 一次抗体は、新しいブロッキング／透過化バッファーで、抗体メーカーが推奨する濃度に希釈してください。
   【注意】一次抗体の最適濃度を決定するために滴定が必要な場合があります。
6. 細胞が完全に覆われるように十分な希釈済み抗体溶液を加えます。通常、96ウェルプレート1ウェルあたり50〜100µLを使用します。
   【注意】カバーガラス上の細胞の場合、希釈した抗体溶液を50〜100µL加え、パラフィルムで気泡がないように重ね、溶液を試料に均一に広げます。試料は蒸発を防ぐため、加湿器内で保管してください。
7. 室温で1〜2時間、または4℃で一晩インキュベートします(4℃で一晩インキュベートを推奨）。蛍光標識一次抗体を使用する場合は、サンプルを遮光してください。
   【注意】核対比染色、レクチン、ファロイジンコンジュゲートなどの他の染色は、このステップで、または標識二次抗体を使用する場合は10)で、標識抗体と一緒に加えることが可能です。
8. PBSで2回洗浄した後、PBSで5分×3回洗浄します。
   【注意】または、細胞をPBSで2回リンスし、PBSで30分間インキュベートした後、PBSでリンスします。細胞は、染色に悪影響を与えることなく、より長い時間PBSに浸しておくことができます。
9. 直接標識した一次抗体を使用する場合は、ステップ12.)に進みます。標識二次抗体を使用する場合は、10.)に進みます。
10. 二次抗体をブロッキング/透過バッファーで1µg/mLに希釈する。5.)と同様に二次抗体溶液で細胞を覆い、遮光して室温で30分〜2時間インキュベートします。
11. 8.)と同様に細胞を洗浄します。
12. EverBrite™ Mounting Mediumなどの蛍光退色防止用封入剤でサンプルをマウントします。チャンバー型カバーガラスまたはマルチウェルカバーガラスプレートの場合、バッファーをすべて取り除き、細胞が完全に覆われるように十分な封入剤を加えます。
13. 画像化するまでは、4℃の暗所にサンプルを保管してください。サンプルは封入剤で、4℃で6ヶ月以上保存することができます。
    【注意】ファロイジン染色は抗体染色よりも安定性に欠けます。ほとんどのファロイディンコンジュゲートによる染色は4℃で数日間安定ですが、最良の結果を得るためには24時間以内に画像化する必要があります。