Sirin Korulu Koc, Francesca Loria, Jevgenia Dering, Paolo Guazzi;
HansabioMed Life Science
植物由来ナノ粒子（ELN, Plant-EVs）とは
Plant EV-Like Nanoparticles (ELN)やPlant-EVsと呼ばれる植物由来ナノ粒子の存在は、1960年代の後半には明らかになっていたにも関わらず、熱心な研究が行われるようになったのはわずか10年ほど前からです。 現在Plant ELN は、極めて安全で生体適合性の高い、治療薬開発における新たな存在です。特に化粧品や栄養補助食品産業において大きな可能性を秘めており、生理活性物質の送達の新たな選択肢となり得ます。 ショウガ、種々のベリー、レモン、グレープフルーツ由来のELNは、抗炎症作用(1)、抗酸化作用(2)を有しています。さらに、これらのplant ELNは、胃や腸を通過し大腸まで到達することで、微生物叢に影響を与える可能性があります(3)。 本アプリケーションノートでは、TFF-MVとTFF-EVを用いたplant ELNの分離におけるタンジェンシャルフローろ過法の有効性と費用対効果についてご紹介します。本方法は、これらのナノ粒子の特徴を維持したまま最適な粒子収量を確保いたします。
ワークフロー
- サンプル準備：シーベリー（サジー）、ショウガ、ガーリックをジューサーで破砕し、得られたジュースを50 µmのフィルターでろ過し、個体残留物を取り除いた。
- 大きいサイズの粒子やデブリを取り除くために、ポアサイズ200 nmのTFF-MVを使用してタンジェンシャルフローろ過を実施した（流速80 mL/min、使用ポンプ：Masterflex L/S 7535-04）。
- Plant ELNの精製は、ポアサイズ50 nmのTFF-EVsフィルターを用いて行った（流速80 mL/min、使用ポンプ：Masterflex L/S 7535-04）。50 mLの1×PBSで3回洗浄し、5mLの1×PBSでPlant ELNを回収した。
結果
１. ナノ粒子の濃度と形状について
A：Zetaview analyzer (Particle Metrix社)を使用したNanoparticle Tracking Analysis (NTA)
| Sample | Particle Concentration (Part/ml) |
Mean Size (nm) |
Volume (ml) |
Total Particles |
|---|---|---|---|---|
| Garlic | 5.4x1011 | 82.5 +/- 6.6 | 5 | 2.7x1012 |
| Seaberry | 5.6x1011 | 117.8+/- 11.4 | 5 | 2.8x1012 |
| Ginger | 4.0x1011 | 101.3+/- 5.6 | 5 | 2.0x1012 |
※撮影条件: Camera sensitivity 85、Shutter 100、Temperature 25°C
B：透過型電子顕微鏡での撮影
透過型電子顕微鏡はHitachi HT7800を100KVで使用した。写真は、Gatan Rio9, model 1809 (Gatan Inc)を使用して撮影した。
２．粒子の特徴および生理活性
A：精製ELNにおけるTET8の発現
ELISAとWBは、1x109 個の精製plant ELNをサンプルとして使用し、抗TET8抗体で検出した。
B：精製ELNのレクチンプロファイル
レクチンプロファイリングにはLectin kit I Fluorescein (Vector Lab社)を使用した。
C：ショウガ由来ELNの酵素活性アッセイ
1.8x1010 nanoparticle/wellのELSのエノラーゼおよびペルオキシダーゼの活性を測定した。
まとめ
TFF-MVとTFF-EVを組み合わせることで、植物由来のナノ粒子（ELN）を素早く、スケーラブルに、かつコスト効率よく精製することができます。精製された粒子は、機能性アッセイやバイオマーカープロファイリングに適しています。
関連情報
(1) Chen, Xingyi, You Zhou, and Jiujiu Yu. "Exosome-like nanoparticles from ginger rhizomes inhibited NLRP3 inflammasome activation." Molecular pharmaceutics 16.6 (2019): 2690-2699.
(2) Zhang, Mingzhen, et al. "Plant derived edible nanoparticles as a new therapeutic approach against diseases." Tissue barriers 4.2 (2016): e1134415.
(3) Munir, Javaria, Mihye Lee, and Seongho Ryu. "Exosomes in food: Health benefits and clinical relevance in diseases." Advances in Nutrition 11.3 (2020): 687-696.
