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GPCRプロファイリングアッセイにご利用頂ける細胞（継代不可）と評価用試薬を同梱したキット PathHunter® eXpress β-Arrestin / 内在化GPCRアッセイキット
DiscoverX社；既知GPCR凍結細胞と評価用試薬・プレートがセットになったReady-to-Useキット

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メーカー名：Eurofins DiscoverX Corporation

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GPCRは、ヒトの場合1,000種類も存在するといわれ、創薬において非常に重要なターゲットです。実際、現在市場に出ている薬剤のうち約60%が、GPCRをターゲットにしています。
DiscoverX社は、オーファンGPCRを含む490種類以上のGPCRを標的とした、ハイスループット対応の細胞ベースアッセイの受託サービスや研究用細胞株、キットを提供しています。
本キットは、標的GPCRおよび試験目的に応じて既知のGPCRやオーファンGPCRの活性評価、GPCR 内在化を指標とした機能的な活性評価など様々な側面から研究をサポートするready-to-useの細胞ベースアッセイキットです。

セカンドメッセンジャーの検討のための凍結細胞を含むeasy-to-useのアッセイキット（cAMP Hunter® eXpressキット）およびcAMP／カルシウムのアッセイキットにつきましては、別ページで紹介しています。

原理

本細胞株によるアッセイでは、DiscoverX社独自の技術；Enzyme Fragment Complementation（EFC）技術を用いて様々な検出システムを確立しています(Fig. 1)。

Known GPCR / Orphan GPCR β-arrestin recruitment

GPCRにリガンドが結合することによりβ-arrestinがリクルートされ、続いて下流のシグナル伝達が誘導されます。既知GPCRおよびオーファンGPCRでは、GPCRリガンドの結合によってβ-arrestinがリクルートされると、GPCRのC末端側に結合したβ-galactosidaseのSmall fragment (ED)と、β-arrestinに付加されたβ-galactosidaseのLarge fragment (EA)とが再構成されて活性型酵素となります。このβ-galactosidase活性により加水分解された基質の化学発光シグナルを測定することにより、GPCRに対する化合物の作用を同定します。(Fig. 2)

Fig1. Enzyme Fragment Complementation（EFC）技術

Fig2. EFC技術による化学発光検出の原理

GPCR Internalization

PathHunter® GPCR Internalization アッセイでは、Activated　Internalization アッセイ及び Total Endocytosis アッセイ 2つの異なるアッセイ原理があります。

Fig.3. Activated GPCR Internalization assay原理

Fig4. Total Endocytosis assay原理

1. Activated　Internalization

Activated Internalizationアッセイでは、細胞のエンドソーム表面に局在化した酵素断片と、β-arrestinに融合された相補的な酵素断片を用います。β-arrestinはターゲット受容体の刺激によりGPCRに結合し、受容体の内在化、エンドソームへの輸送が起こります。その結果、２つの酵素断片の補完が起こり、酵素活性の増加を化学発光検出試薬により容易に測定できます。

2. Total Endocytosis

Total Endocytosisアッセイでは、細胞のエンドソーム表面に局在化した酵素断片と、ターゲット受容体に付加された相補的な酵素断片を用います。リガンドやアゴニストの刺激によりターゲット受容体が細胞内に取り込まれ、エンドソームへの輸送が起こります。その結果、β-arrestinに依存せずに２つの酵素断片の補完が起こり、酵素活性の増加を化学発光検出試薬により容易に測定できます。

特長

細胞培養接着後、数時間でアッセイ可能な簡便プロトコール（下記プロトコールを参照）
化学発光検出、簡便なプロトコールによるハイスループットスクリーニングアッセイ
目的ターゲットの同ファミリーや動物種のプロファイリングに最適
オーファンGPCRや異なるGタンパク質(Gi, Gq, Gs)とカップリングする様々なGPCRに対して、横断的に化合物の特異性や選択性の比較が可能(Fig. 5)
アゴニスト、アンタゴニスト、アロステリックモジュレーターの他、部分アゴニストやインバースアゴニストの同定も可能(Fig. 6)

β-arrestin recruitment

リガンド結合に続いて最初に起こるシグナル伝達を確認可能な細胞ベースのアッセイ
受容体とβ-arrestinの1:1の結合を見ることにより、偽陽性・偽陰性の少ないデータの入手が可能

Internalization

スーパーアゴニストや機能的アンタゴニストなどの評価に適した機能的アッセイ

Fig5. PathHunterによるGi/Gq/Gsタンパク質それぞれの評価

Fig6. アドレナリンB2受容体に対するアゴニスト、パーシャルアゴニスト、アンタゴニストの評価

キット構成

96 wells フォーマットにて３種類(100、 200、 1,000 data point (dp))のサイズをご用意しております。

PathHunter® eXpressキット	100 dp	200 dp	1,000 dp	保管条件
Box1 PathHunter eXpress GPCR Cells	1x10e6 cells / 1 vial	2x10e6 cells / 2 vials	10x10e6 cells / 10 vials	-80°C (短期) Liquid N2 (長期)
Box 2: PathHunter Detection Reagents - Cell Assay Buffer - Substrate Reagent 1 - Substrate Reagent 2 * Cell Plating Reagent **	5.7 mL 1.5 mL 0.3 mL 1 x 20.0 mL	9.5 mL 2.5 mL 0.5 mL 2 x 20.0 mL	57.0 mL 15.0 mL 3.0 mL 2 x 100 mL	-20°C
Box 3: 96-well Tissue Culture Treated Plates	1 plate	2 plates	10 plates	Room Temperature