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商品情報

記事ID : 1027
研究用

GPCRプロファイリングアッセイにご利用頂ける細胞(継代不可)と評価用試薬を同梱したキットPathHunter® eXpress β-Arrestin / 内在化GPCRアッセイキット
DiscoverX社;既知GPCR凍結細胞と評価用試薬・プレートがセットになったReady-to-Useキット

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PathHunter_eXpress_beta-Arrestin_known_GPCR_AssayKit.jpg

GPCRは、ヒトの場合1,000種類も存在するといわれ、創薬において非常に重要なターゲットです。実際、現在市場に出ている薬剤のうち約60%が、GPCRをターゲットにしています。
DiscoverX社は、オーファンGPCRを含む490種類以上のGPCRを標的とした、ハイスループット対応の細胞ベースアッセイの受託サービスや研究用細胞株、キットを提供しています。
本キットは、標的GPCRおよび試験目的に応じて既知のGPCRやオーファンGPCRの活性評価、GPCR 内在化を指標とした機能的な活性評価など様々な側面から研究をサポートするready-to-useの細胞ベースアッセイキットです。

 

セカンドメッセンジャーの検討のための凍結細胞を含むeasy-to-useのアッセイキット(cAMP Hunter® eXpressキット)およびcAMP/カルシウムのアッセイキットにつきましては、別ページで紹介しています。

原理

本細胞株によるアッセイでは、DiscoverX社独自の技術;Enzyme Fragment Complementation(EFC)技術を用いて様々な検出システムを確立しています(Fig. 1)。

 

Known GPCR / Orphan GPCR β-arrestin recruitment

GPCRにリガンドが結合することによりβ-arrestinがリクルートされ、続いて下流のシグナル伝達が誘導されます。既知GPCRおよびオーファンGPCRでは、GPCRリガンドの結合によってβ-arrestinがリクルートされると、GPCRのC末端側に結合したβ-galactosidaseのSmall fragment (ED)と、β-arrestinに付加されたβ-galactosidaseのLarge fragment (EA)とが再構成されて活性型酵素となります。このβ-galactosidase活性により加水分解された基質の化学発光シグナルを測定することにより、GPCRに対する化合物の作用を同定します。(Fig. 2)

Enzyme Fragment Complementation(EFC)技術
Fig1. Enzyme Fragment Complementation(EFC)技術
EFC技術による化学発光検出の原理
Fig2. EFC技術による化学発光検出の原理

GPCR Internalization

PathHunter® GPCR Internalization アッセイでは、Activated Internalization アッセイ 及び Total Endocytosis アッセイ 2つの異なるアッセイ原理があります。

Activated GPCR Internalization assay原理
Fig.3. Activated GPCR Internalization assay原理
Total Endocytosis assay原理
Fig4. Total Endocytosis assay原理

1. Activated Internalization

Activated Internalizationアッセイでは、細胞のエンドソーム表面に局在化した酵素断片と、β-arrestinに融合された相補的な酵素断片を用います。β-arrestinはターゲット受容体の刺激によりGPCRに結合し、受容体の内在化、エンドソームへの輸送が起こります。その結果、2つの酵素断片の補完が起こり、酵素活性の増加を化学発光検出試薬により容易に測定できます。

2. Total Endocytosis

Total Endocytosisアッセイでは、細胞のエンドソーム表面に局在化した酵素断片と、ターゲット受容体に付加された相補的な酵素断片を用います。リガンドやアゴニストの刺激によりターゲット受容体が細胞内に取り込まれ、エンドソームへの輸送が起こります。その結果、β-arrestinに依存せずに2つの酵素断片の補完が起こり、酵素活性の増加を化学発光検出試薬により容易に測定できます。

特長

  • 細胞培養接着後、数時間でアッセイ可能な簡便プロトコール(下記プロトコールを参照)
  • 化学発光検出、簡便なプロトコールによるハイスループットスクリーニングアッセイ
  • 目的ターゲットの同ファミリーや動物種のプロファイリングに最適
  • オーファンGPCRや異なるGタンパク質(Gi, Gq, Gs)とカップリングする様々なGPCRに対して、横断的に化合物の特異性や選択性の比較が可能(Fig. 5)
  • アゴニスト、アンタゴニスト、アロステリックモジュレーターの他、部分アゴニストやインバースアゴニストの同定も可能(Fig. 6)

 

β-arrestin recruitment

  • リガンド結合に続いて最初に起こるシグナル伝達を確認可能な細胞ベースのアッセイ
  • 受容体とβ-arrestinの1:1の結合を見ることにより、偽陽性・偽陰性の少ないデータの入手が可能

Internalization

  • スーパーアゴニストや機能的アンタゴニストなどの評価に適した機能的アッセイ
PathHunter(R)によるGi/Gq/Gsタンパク質それぞれの評価
Fig5. PathHunterによるGi/Gq/Gsタンパク質それぞれの評価
DRX_PathHunterexpresskit_04.gif
Fig6. アドレナリンB2受容体に対するアゴニスト、パーシャルアゴニスト、アンタゴニストの評価

 

 

キット構成

96 wells フォーマットにて3種類(100、 200、 1,000 data point (dp))のサイズをご用意しております。

PathHunter® eXpressキット 100 dp 200 dp 1,000 dp 保管条件
Box1
PathHunter eXpress GPCR Cells
1x10e6 cells
/ 1 vial
2x10e6 cells
/ 2 vials
10x10e6 cells
/ 10 vials
-80°C (短期)
Liquid N2 (長期)
Box 2:
PathHunter Detection Reagents
- Cell Assay Buffer
- Substrate Reagent 1
- Substrate Reagent 2 *
Cell Plating Reagent **
5.7 mL
1.5 mL
0.3 mL
1 x 20.0 mL
9.5 mL
2.5 mL
0.5 mL
2 x 20.0 mL
57.0 mL
15.0 mL
3.0 mL
2 x 100 mL
-20°C
Box 3:
96-well Tissue Culture Treated Plates
1 plate 2 plates 10 plates Room
Temperature

*開封前に遠心して試薬を底に落としてください
**GPCRターゲットごとに異なりますので、データシートを参照ください

<特記事項>
Control agonistは同梱されておりません。
本品は全てカルタヘナ商品のお取扱となります。
詳細につきましては、下記の営業部 創薬営業ユニットまでお問い合わせ下さい。

プロトコール

  1. 細胞を解凍後、同キットに付属の培地を加えて、96 wellプレートに播種 (24または48時間、37℃)
  2. 被験物質溶液を加える(DMSOまたはEtOH)、(90分以上、25℃ or 37℃)
  3. 検出試薬を加える (60分、室温)
  4. 化学発光シグナルを検出(検出機器:Viewlux, Victor, Turnerなど)
プロトコール
 

ターゲットリスト

こちらをご参照ください。  ターゲットリスト

関連ページ

お問い合わせ先 : 営業部 創薬営業ユニット

価格等詳細につきましては、当社 営業部 創薬営業ユニット までお問合せください。

TEL
03-5632-9616
FAX
03-5632-9614
E-mail
dds_info@cosmobio.co.jp

商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

お問い合わせ

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