QuickZyme Biosciences社製品の紹介 特集：コラーゲンの測定・定量方法

コラーゲンの各測定方法およびコラーゲン測定キットをご紹介します。

コラーゲン（collagen）とは？

コラーゲンとは、体を構成する総タンパク質の約30％を占め、脊椎動物の体内で最も豊富に存在するタンパク質です。コラーゲンは、組織の構造で重要な役割を果たしているほか、細胞増殖、分化、組織修復でも機能し、多くの病理状態にも関係しています。コラーゲンは細胞外マトリックスタンパク質のファミリーで、脊椎動物では少なくとも27種類のコラーゲンが同定されており、42種類の異なるポリペプチド鎖から構成されています。I型、II型、III型、V型、XI型、XXIV型、XXVII型コラーゲンは、細線維を形成し三本鎖らせん構造をとる線維形成コラーゲンです。

コラーゲンの特徴としてヒドロキシプロリン残基の存在があり、ヒドロキシプロリンはコラーゲン三本鎖らせんの安定化に必要です。一部のコラーゲンは、限定された組織分布を示します。例えば、II型コラーゲン、IX型コラーゲン、IX型コラーゲンおよびXI型コラーゲンは、軟骨に分布し、IV型コラーゲンは基底膜中に存在します。I型コラーゲン、II型コラーゲン、III型コラーゲンは、組織中で最も豊富に存在するコラーゲンです。

ヒト体内にはおよそ3 kg以上のコラーゲン量が存在しますが、コラーゲンは、精製および分析が困難な分子です。その一因として、多様な架橋によって大規模なネットワークを形成したコラーゲン分子は不溶性で抽出が困難なことがあげられます。

多様な種類のコラーゲンを解析するアッセイ方法としては、以下の方法があります。

• ELISA法：
  • 特定の型のコラーゲンを測定
  • コラーゲンの前駆体ドメインを測定
• ウェスタンブロット（Western blotting）法：
  コラーゲン抗体を使用して特定コラーゲンを検出
• シリウスレッド（Sirius Red）染色：
  可溶性コラーゲンを測定
• 組織加水分解処理サンプルの解析（比色測定またはHPLC）

• マウス組織からのコラーゲン測定 
  様々なマウス組織を用いて、異なるコラーゲン測定方法（可溶性コラーゲンアッセイ、トータルコラーゲンアッセイ、HPLC法）について比較を行っています。
• 魚類組織からのコラーゲン測定 
  トータルコラーゲンアッセイを使用して、魚類組織（テラピア：Tilapia）のコラーゲン測定について検討を行っています。
• コラーゲン / 総タンパク質解析 
  様々なサンプル（凍結組織、ホルマリン固定組織、パラフィン包埋組織）から、総タンパク質中に占めるコラーゲンの割合について検討を行っています。

■ 可溶性コラーゲン定量アッセイキット

可溶性コラーゲン定量アッセイキットは、可溶性コラーゲンまたは酸/ペプシン処理で可溶化したコラーゲンを測定します。

本製品は、96ウェルプレートフォーマットで、シリウスレッド（Sirius-Red；スルホン基をもつアニオン性色素）とコラーゲンとの沈殿形成に基づいて行われます。Sirius Red は、塩基性アミノ酸残基の側鎖基に結合します。高pHでは、Sirius Redとコラーゲン複合体の沈殿からSirius Redが放出されるため、結合量の比色測定を行うことができます。アルブミンなどの他のタンパク質は干渉せず、ゼラチン（unfolded collagen）もまた認識されません。

• 【アプリケーション】
  ：可溶性コラーゲンの測定。
• 【適用サンプル】
  ：培養上清、細胞抽出物などから可溶化したコラーゲン

■ トータルコラーゲン定量アッセイキット

トータルコラーゲン定量アッセイキットは、全ての型のコラーゲン（mature、immature、procollagen、degraded collagen、crosslinked collagen、collagen from various sources）を測定します。

本製品は、96ウェルプレートフォーマットで、ヒドロキシプロリン（主にコラーゲンに存在するアミノ酸）検出に基づいて測定を行います。ヒドロキシプロリンは、コラーゲン含有サンプルの酸加水分解によって、コラーゲンから放出されます。95℃で加水分解処理をしたサンプルは、洗浄や乾燥の工程なしで直接ヒドロキシプロリン解析に使用できます。アッセイは、Chloramine T/DMAB を使用して行われます。

• 【アプリケーション】
  ：全ての型のコラーゲン（procollagen、unfolded collagen、mature collagen as well as collagen degradation products of all collagen types present in the sample）の測定。
• 【適用サンプル】
  ：培養上清、細胞抽出物、組織ホモジネート、組織（サンプルは最初のステップで完全に加水分解されるため、困難なコラーゲン抽出作業を必要としません。）

■ ヒドロキシプロリン定量アッセイキット

ヒドロキシプロリン定量アッセイキットは、トータルコラーゲン定量アッセイキットと基本的には同一ですが、加水分解用のチューブおよびコラーゲン測定用のプロトコルは含まれていません。

• 【アプリケーション】
  ：トータルコラーゲン定量アッセイキットと同じアプリケーション領域で使用できますが、独自の酸加水分解の方法を持っているお客様や測定用の加水分解サンプルをお持ちのお客様に最適です。
• 【適用サンプル】
  ：培養上清、細胞抽出物、組織ホモジネート、組織

［関連製品］総タンパク質定量アッセイキット

総タンパク質定量アッセイキットは、酸加水分解産物中の総タンパク質量を定量するキットです。

あらゆる組織（新鮮、凍結、ホルマリン固定、パラフィン包埋）の酸加水分解産物からタンパク質定量が可能です。アミノ酸の比色定量法を原理としており、特別な装置を必要とせずに迅速で簡便なアッセイを実現します。本製品は酸加水分解サンプル中コラーゲン量の標準化（ノーマライゼーション）に最適です。

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