トランスフェクションの必要なし！生細胞中のオートファジーを迅速に検出 CYTO-ID® オートファジー検出キット 2.0

生細胞でオートファジー小胞の検出やオートファジーフラックスのモニターが可能なキットです。オートファジー小胞を選択的に染色する蛍光プローブが含まれているため、トランスフェクションの必要がなく、迅速かつ定量的な検出が可能です。

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＊本製品はCYTO-ID® オートファジー検出キット(品番：ENZ-51031-K200、ENZ-51031-0050)と染色メカニズムは同様ですが、蛍光プローブの改良により染色の鮮明さと光安定性が向上しています。

オートファジー（Autophagy）とは？

オートファジーはストレスによって誘導される防御機構です。基本的な生理条件下ではその活性は低く、様々な生理的条件下 (栄養飢餓、低酸素、エネルギー枯渇、小胞体ストレス、温度上昇、高密度成長条件下、ホルモン刺激) やタンパク質凝集症 (アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病)、心疾患、急性膵炎のほか細菌感染や寄生虫感染といった条件下におくと顕著にアップレギュレートされます。またオートファジー機能の低下は老化の特徴とされています。

図1. オートファジーの模式図
細胞質成分が隔離膜（phagophore, ファゴフォア）によって隔離され、二重膜小胞（autophagosome, オートファゴソーム）が形成される。その後、オートファゴソームの外膜はリソソームと融合し、内包された物質はオートリソソーム内で分解される。

本キットに含まれる緑色蛍光プローブは、カチオン性両親媒性トレーサー （Cationic Amphiphilic Tracer, CAT）色素であり、リン脂質症誘発薬物と似たプロセスで細胞内に素早く入り込みます。色素の官能基を最適化することで、リソソームへの色素の蓄積を抑えながら、プレオートファゴソーム、オートファゴソーム、オートリソソーム（オートファゴリソソーム）といったオートファジー経路に関連する小胞を特異的に染色し、定量することが可能です。

• オートファジー小胞を特異的に染色
• トランスフェクションの必要なし
• 従来のオートファジー検出用蛍光プローブ（Monodansylcadaverine, MDC）と比較して、より明るく光定性の高いプローブを使用
• リソソーム染色によるバックグラウンドを低減
• オートファジー活性化剤および阻害剤のハイスループットスクリーニングを容易に
• オートファジー誘導剤（Rapamycin）、リソソーム阻害剤（Chloroquine）も付属

• CYTO-ID® Green 検出試薬2
• Hoechst 33342（核染色試薬）
• ラパマイシン（オートファジー誘発剤）
• クロロキン（リソソーム阻害剤）
• 10X アッセイバッファー

■検出方法

• 蛍光/共焦点顕微鏡（接着細胞）
• 蛍光/共焦点顕微鏡（浮遊細胞）
• フローサイトメトリー
• 蛍光マイクロプレートリーダー

下記のリンクより、メーカープロトコールをご覧になれます。
メーカープロトコール

図2. CYTO-ID® Green 検出試薬2 によるHeLa細胞の染色
A：通常培地で4時間培養
B：クロロキン 40µMを含む飢餓培地（EBSS）で4時間培養
クロロキン含有EBSSで培養した細胞は非常に鮮明な染色像を示した。

図3. フローサイトメトリーによるJurkat細胞のオートファジープロファイリング
Jurkat細胞をそれぞれ0.5µM ラパマイシン（RAP）、10µM クロロキン（CLQ）、ラパマイシンとクロロキンの両方（RAP+CLQ）で20時間処理した。CYTO-ID® Green 検出試薬2で30分間染色し、フローサイトメトリーで解析した。RAP＋CLQで処理した細胞で蛍光強度が上昇した。

図4. マイクロプレートベースでのHepG2細胞のオートファジープロファイリング
HepG2細胞をそれぞれ0.5µM ラパマイシン（Rap）、10µM クロロキン（CLQ）、ラパマイシンとクロロキンの両方（Rap+CLQ）で20時間処理した。また、細胞数を標準化するためにHoechst 33342で核染色を行った。Rap+CLQで処理した細胞でオートファジーの増加が確認された。

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