次世代シークエンス技術を用いた次世代 shRNA ライブラリ登場！ ヒト/マウス shRNA レンチウイルスライブラリ

本製品は、レンチウイルスベクターシステムと次世代シークエンスの技術を合わせた、画期的なハイスループットRNAi遺伝子スクリーニングツールです。各shRNAコンストラクトにあらかじめ導入したバーコード配列を次世代シークエンサーで検出することにより、プール型ライブラリの課題であった「表現系選抜後の主要調節因子の特定」の正確性が、従来のレンチウイルスライブラリと比較して飛躍的に向上しています。ウイルスの自己複製能を欠損させた安全なシステムです。また、ご希望の遺伝子群を標的としたカスタムshRNA ライブラリを作製（有償）することも可能です。

レンチウイルスの特長

• 宿主ゲノムへの組込み：長期安定発現
• 細胞分裂の活発な細胞/ 非分化細胞いずれにも導入可能
• ウイルスの自己複製能を欠損させた安全なシステム

• プール型レンチウイルスshRNA ライブラリ：
  低コストかつ少人数でのゲノムワイド遺伝子探索実験を実現
• 検証済みshRNAデータベースを整備：
  機能的shRNA を独自のin silico プログラムで予測、shRNAコンストラクトを構築し、一部（50〜100コンストラクト）を実験的に検証してアルゴリズムを評価済み
• shRNA 構造最適化済み：
  ノックダウン効果の向上、偽陽性候補の低減
• shRNA 配列決定が簡便化：
  各shRNA に特異的なbar-code をシークエンスすることにより目的の表現型に関与するshRNAをハイスループットかつ効率的に同定
• レンチウイルスシステムの利用：
  コンプレキシティ（shRNAコンストラクトの密度）の高いプール型ライブラリを効率よく、かつ広範囲な細胞種に導入可能、宿主ゲノムへ組み込まれるので長期安定発現が期待でき、細胞分裂の活発な細胞、非分化細胞のいずれにも導入可能

図1
左：pRSI レンチウイルスshRNA 発現ベクターマップ
実験系に合わせてライブラリに使用するベクターをカスタマイズが可能です。
＊ DECIPHER shRNAライブラリは選択マーカーの変更ができません（薬剤マーカー：Puro、蛍光マーカー：RFP）
右：shRNA特異的bar-code
ユニークなshRNA 特異的bar-code で主要調節因子（効果のあったshRNA）を特定する。bar-code は三重（triplicate）まで設定可能。

図3　RFP-target レポーターのノックダウン機構
ゲノムDNA 上に統合されたshRNA-target レンチウイルスレポーターコンストラクトの略図およびRFP-target レポーターのノックダウン機構。
機能的shRNA を発現する細胞は低レベルのRFPmRNA 発現を、非機能的shRNA を発現する細胞は高レベルのRFP mRNA 発現が確認できた。

図4　ハイスループットRNAi TGF-βスクリーニングデータ比較
手法：セレクタ社25K shRNA library/6.5K target　Validated library、競合他社#1 human 25K lentiviral shRNA library、競合他社#2 human 200K lentiviral shRNA library を同一条件下（MOI＝0.5）かつ各ライブラリコンプレキシティの50 - 100倍の多重度にてHep3B細胞へトランスダクションした。細胞は低密度に播種し、TGF-β（1ng/mL）処理を3週間行った。TGF-βアポトーシスを抑制するshRNA 候補をTGF-β耐性細胞のゲノムDNA から増幅し、シークエンシング（競合他社ライブラリ＃1）、Aff ymetrix U133+2 array へのハイブリダイゼーション（競合他社ライブラリ＃2）、Illumina-Solexa Genome Analyzer を用いた次世代シークエンシング（Cellecta 社ライブラリ）により同定した。各TGF-βゲノムスクリーニングは2回繰り返して行い、同定された既知TGF-βエフェクターをまとめた。
結果：競合他社ライブラリ＃1 からはTGF-β受容体タイプ1のみ同定された。競合他社ライブラリ＃2 からはTGF-βシグナル経路への関与が知られているものとしてはSMAD4 のみが同定され他方は本経路への関与が未知の遺伝子であった。個々のshRNAコンストラクトを用いた確認実験より、競合2社のライブラリを用いた1 次スクリーニング結果には高確率（90 - 95％）で偽陽性シグナルが含まれることが示唆された。
これに対し、セレクタ社25K ライブラリの1次スクリーニングでは、TGF-βシグナル経路に関与する既知および新規遺伝子が100 種類以上同定された。繰り返し実験で再現性がみられた（〜80％）と同時に、確認実験でも同様の結果が得られた（〜 95％）。TGF-βシグナル経路に関与する既知因子（SMAD4, type I and type II TGF-βreceptors, WNT5A 等）が同定されたことに加え、PI3K/NF-kB シグナル経路に関与する因子が数多く同定されたことから、Hep 3B において本経路がTGF-βの介するアポトーシスに重要な役割を担うことが示唆された。

• Cellecta社 プール型レンチウイルスshRNAライブラリ FAQ
• 技術情報:定量的shRNAスクリーニングによる新規幹細胞機能制御遺伝子の同定

関連情報

• 特集：レンチウイルス（レンチウイルスベクターシステム）

※  表示価格について