デュアル（ホタル Firefly / ウミシイタケ Renilla）ルシフェラーゼアッセイキット Luc-Pair™ Duo-Luciferase HS Assay Kit（高感度）

Luc-Pair™ Duo-Luciferase HS Assay Kit は、ホタルルシフェラーゼ（FLuc） および ウミシイタケルシフェラーゼ（Rluc）活性を高感度に検出できるキットです。

様々な真核細胞（哺乳動物、無脊椎動物など）を用いたアッセイに使用でき、マイクロプレート／シングルチューブルミノメーターを用いて測定します。GeneCopoeia社、Promega社などの多くの Fluc および Rluc ベクターに対応します。

本キットは、miRNA の標的配列への阻害効果の測定など、様々なアプリケーションに適しています。

Luc-Pair™ ルシフェラーゼアッセイキット　選択ガイド

ルシフェラーゼについて

レポーター遺伝子発現を用いた転写調節解析は、細胞生物学や医薬品開発で一般的に利用されています。ルシフェラーゼは、以下の利点を持っており、遺伝子発現研究で最も広く使用されるレポーター遺伝子です。

1. 広いダイナミックレンジ・高感度
2. 哺乳類細胞に存在しない
3. 一貫性・再現性
4. 費用対効果の高さ
5. 簡便なアッセイ
6. ハイスループットスクリーニングに最適

2種類のルシフェラーゼ

ホタル（Firefly）とウミシイタケ（Renilla）由来のルシフェラーゼは、簡便で迅速、高感度なアッセイが可能であるため広く使用されています。これらは、進化的起源が異なり、酵素の構造と基質が大きく違うことから、デュアルアッセイに理想的です。

• ホタル由来のルシフェラーゼ

  ホタル（Photinus pyralis）ルシフェラーゼは、プロモーター活性や転写後調節の両方をモニターするために最適なレポーターで、61kDaの細胞質酵素です。発光強度は、ルシフェラーゼ量に比例し、ルミノメーターまたは多機能マイクロプレートリーダーを用いて測定されます。

  
  図1. ホタルルシフェラーゼの触媒反応

• ウミシイタケ由来のルシフェラーゼ

  ウミシイタケ（Renilla reniformis）ルシフェラーゼは、翻訳後修飾を必要としない36kDaの単量体タンパク質です。したがって、リアルタイムでの転写レポーターとして有用です。本酵素は、以下の反応を触媒します。

  
  図2. ウミシイタケルシフェラーゼの触媒反応

ルシフェラーゼアッセイでは、目的遺伝子に近接するシスエレメントの転写活性をモニターすることができます。しかしながら、miRNAによる標的遺伝子3'UTR領域の調節を介した転写抑制効果の測定に関しては、その酵素基質活性の範囲が小さいために今まで困難でした。真の転写抑制効果をモニターするためには、より長期間安定な酵素基質複合体が必要です。

また、生物学的ばらつきや確率論的現象がノイズとして結果に影響します。実際のシグナルと非特異的な応答を区別するためには、独立したコントロールレポーターを用いてレポーター遺伝子の発現を標準化します。これは、トランスフェクション効率や細胞生存率の補正にも必要です。

本製品は、ホタルルシフェラーゼとウミシイタケルシフェラーゼの構造と基質の違いを利用し、2種類のルシフェラーゼ活性を連続的に測定することができ、ウミシイタケルシフェラーゼをコントロールレポーターとして利用できます。アッセイでは、単一サンプル中のホタルルシフェラーゼ活性とウミシイタケルシフェラーゼ活性を順番に測定します。第一の試薬を加えるとホタルルシフェラーゼが発光し、第二の試薬によってホタルルシフェラーゼが消光すると同時にウミシイタケルシフェラーゼの発光が生じます。

• 高感度 - ホタル（Firefly）・ウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼシグナルを高感度に検出（図1）
• 多用途 - 様々な真核細胞（哺乳動物、無脊椎動物など）を用いたアッセイに使用でき、マイクロプレート／シングルチューブルミノメーターを用いて測定
• 低いバックグラウンド - バックグラウンドが非常に低く、減算が不要
• 簡単 - ウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼバッファーと基質には、ホタルルシフェラーゼ活性のクエンチャーが含まれており（図2）、quick Glow と Stop-N-Glow の2ステップアッセイが可能
• 再現性 - 広い範囲で線形性が保たれた信頼性の高い結果
• 互換性 - Promega社 Fluc / Rluc ベクターに対応

• Luc-Lysis II Buffer (10×) ： 細胞溶解バッファー
• Luc-H Buffer I (5×) ： ホタル（Firefly）ルシフェラーゼバッファー
• Luc-H Sub I (100×) ： ホタル（Firefly）ルシフェラーゼ基質
• Luc-H Buffer II (5×) ： ウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼバッファー
• Luc-H Sub II (100×) ： ウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼ基質

図1 ホタル（Firefly）ルシフェラーゼ および ウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼ活性
HEK 293 細胞に、Promega社 pGL4.13/pGL4.75 レポーターベクターを48時間トランスフェクションした。プロトコールに従い、Fluc（FLuc-GeneCopoeia）および Rluc（RLuc-GeneCopoeia）活性を測定した。他社のキット（FLuc-他社 および RLuc-他社）を比較のために用いた。

図2 Luc-H Buffer II の添加による、ホタルルシフェラーゼ活性の消光
Promega社 pGL4.13/pGL4.75 レポーターベクターを、HEK 293 細胞に48時間トランスフェクションした。プロトコールに従い、ホタルルシフェラーゼ活性を測定した。次に、各ウェルに 1x Luc-H Buffer II（基質なし／あり）を添加し、ルミノメーターで測定した。約 99.9% のホタルルシフェラーゼ活性が消光された（中央のカラム）。

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• miTarget™ miRNA 標的配列3'UTR発現クローン
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Luc-Pair™ ルシフェラーゼアッセイキット　ラインアップ

• Luc-Pair™ Duo-Luciferase Assay Kit 2.0（優れた安定性）
• Luc-Pair™ Duo-Luciferase HS Assay Kit（高感度）
• Luc-Pair™ Firefly Luciferase HS Assay Kit（高感度）
• Luc-Pair™ Renilla Luciferase HS Assay Kit（高感度）

選択ガイド

	ベクター	Luc-Pair™ Luciferase Assay Kit
		Duo-Luciferase Assay Kit 2.0	Duo-Luciferase HS Assay Kit	Firefly Luciferase HS Assay Kit	Renilla Luciferase HS Assay Kit
レポーター遺伝子		ホタル ・ウミシイタケ ルシフェラーゼ	ホタル ・ウミシイタケ ルシフェラーゼ	ホタル ルシフェラーゼ	ウミシイタケ ルシフェラーゼ
主な特長		安定性が向上	高感度	高感度	高感度
miTarget™ 3′ UTR miRNA Target Clones	pEZX-MT05
	pEZX-MT06
GeneCopoeia社 ベクターオプション	pEZX-FR01 （品番： ZX001）
	pEZX-FR02 （品番： ZX002）
	pEZX-FR03 （品番： ZX003）
Promega社 ベクターオプション	pGL4 Luciferase Reporters vectors
	pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vectors

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