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研究用

フローサイトメトリー解析やイメージングに有用PROTEOSTAT® アグリソーム検出キット

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PROTEOSTAT® アグリソーム検出キットは、アグリソームやアグリソーム様凝集体をフローサイトメトリーやイメージングで解析します。

使用目的

PROTEOSTAT® アグリソーム検出キットには、488 nm で励起する赤色蛍光分子ローター色素が含まれており、固定細胞や透過処理済み細胞のアグリソームやアグリソーム様封入体内に存在する、変性カーゴタンパク質を特異的に検出します。検出試薬はアグリソーム形成中に生産された小胞内の凝集タンパク質と結合することで強く蛍光を発します。そしてオートファジー、プロテアソーム経路の様々な条件下でバリデートされています。

キットには、プロテアソーム阻害剤である MG-132 がポジティブコントロールとして、また核の対比染色試薬も入っています。

  • 文献で使用されているサンプル一覧はこちら PDF

特長

  • セルベースアッセイによる薬剤応答アッセイ:実際の生細胞条件下での神経変性疾患に関与するインヒビターを同定可能
  • 信頼性が高く簡便:非生理的なタンパク質のミューテーションや遺伝子組換え細胞株不要
  • 固定化細胞アッセイ:凝集したタンパク質とアグリソーム形成に関わる様々なタンパク質間の相互作用を解析可能
  • フローサイトメトリーでアグリソーム蓄積を簡単定量

構成内容

  • PROTEOSTAT® アグリソーム検出試薬
  • Hoechst 33342 Nuclear stain
  • プロテアソームインヒビター(MG-132)
  • アッセイバッファー(×10)

テックノート

使用例

PROTEOSTAT アグリソーム検出キットの使用例

Treatment Mean(FL3)Signal
Control 113
Treatment(5μM MG-132) 335


図1 フローサイトメトリーによるアグリソーム解析
Jurkat細胞を5μM MG-132で一晩37℃誘導したものとmockを用意。処理後、細胞を固定し PROTEOSTAT® 検出試薬とインキュベートした。フローサイトメトリーで検出したヒストグラムを示す。
MG-132処理細胞では、赤色蛍光シグナルが約3倍増加した。

 

PROTEOSTAT 検出試薬で検出されるアグリソームはFITC標識ユビキチン抗体と共通の局在
図2 PROTEOSTAT® 検出試薬で検出されるアグリソームはFITC標識ユビキチン抗体と共通の局在を示す。

 

α-syn混合物はM17神経芽細胞系に内在する細胞原形質膜で凝集体を形成する。

図3 α-syn 混合物は M17 神経芽細胞系に内在する細胞原形質膜で凝集体を形成する。
α-syn モノマーで処理した M17 細胞(M)、ソニケートした α-syn PFFs で処理した M17 細胞(F)、α-syn 混合物で処理した M17 細胞(M+F)。4日後、M17 細胞を固定前に3回洗浄し、それから PROTEOSTAT® アグリソーム検出試薬(緑)で染色、α-syn(赤)および β-catenin(グレイ)に対する抗体を使い、免疫染色を行った。スケールバー = 20 µm。
(“Fibril growth and seeding capacity play key roles in α-synuclein-mediated apoptotic cell death. A-L Mahul-Mellier, et al.; Cell Death & Differentiation (2015).” (doi:10.1038/cdd.2015.79))

 

オートファジーに関連するERストレスによって誘導されたタンパク質アグリソームのフローサイトメトリー解析

図4 オートファジーに関連するERストレスによって誘導されたタンパク質アグリソームのフローサイトメトリー解析
K562 細胞を CQ(25, 50, 75 µM)、thapsigargin(Tg :100 nM)、MG-132(5 µM)で24時間処理、もしくは未処理を用意した。その後、固定・透過処理を行い、PROTEOSTAT® アグリソーム検出試薬(1:10,000 希釈)を室温で30分反応させた。その後、細胞(30,000)を BD LSR II、610/20nm(青)チャンネルで解析した。
(Courtesy of the Flow Cytometry Core Facility, Blizard Institute, Queen Mary University of London, London, UK.)

 

オートファジーに関連するERストレスによって誘導されたアグリソームやアグリソーム様封入体 (ALSI) の落射蛍光顕微鏡画像

図5 オートファジーに関連するERストレスによって誘導されたアグリソームやアグリソーム様封入体(ALSI)の落射蛍光顕微鏡画像
A) 未処理の K562 細胞、B) MG-132(5 µM)、C) CQ(50 µM)、D) thapsigargin(Tg: 100 nM)で24時間処理、その後、固定・透過処理を行い、PROTEOSTAT® アグリソーム検出試薬(1:10,000 希釈)を室温で30分反応させた。PROTEOSTAT® アグリソーム染色には、アグリソーム、ALIS 細胞を赤色で、DAPI 染色を青色で示す。
(Courtesy of the Flow Cytometry Core Facility, Blizard Institute, Queen Mary University of London, London, UK.)

PROTEOSTAT® アグリソーム検出キット

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
PROTEOSTAT(R) Aggresome detection kit for flow cytometry and fluorescence microscopy詳細データ ENZ ENZ-51035-K100 1 KIT
[100 flow cytometry assays or 200 microscopy assays]
¥57,000
PROTEOSTAT(R) Aggresome detection kit for flow cytometry and fluorescence microscopy詳細データ ENZ ENZ-51035-0025 1 KIT
[25 flow cytometry assays or 50 microscopy assays]
¥20,000

製品使用文献

  1. Monitoring of dipeptidyl peptidase-IV (DPP-IV) activity in patients with mucopolysaccharidoses types I and II on enzyme replacement therapy - Results of a pilot study: K. Hetmanczyk, et al.; Clin. Biochem. 49, 458 (2016), Application(s): Plasma DPP-IV enzyme assay, Abstract;
  2. A fast and specific method to screen for intracellular amyloid inhibitors using bacterial model systems: S. Navarro, et al.; Eur. J. Med. Chem. (2015), Application(s): Confocal microscopy, Abstract;
  3. Amyloidogenic lysozymes accumulate in the endoplasmic reticulum accompanied by the augmentation of ER stress signals: Y. Kamada, et al.; Biochim. Biophys. Acta 1850, 1107 (2015), Application(s): Microscopy, Abstract;
  4. Conophylline protects cells in cellular models of neurodegenerative diseases by inducing mammalian target of rapamycin (mTOR)-independent autophagy: Y. Sasazawa, et al.; J. Biol. Chem. 290, 6168 (2015), Abstract;
  5. Decreased proteasomal function accelerates cigarette smoke-induced pulmonary emphysema in mice: Y. Yamada, et al.; Lab. Invest. 95, 625 (2015), Application(s): Aggresome detection by fluorescence microscopy in fibroblasts, Abstract;
  6. Defective autophagy is a key feature of cerebral cavernous malformations: S. Marchi, et al.; EMBO Mol. Med. 7, 1403 (2015), Application(s): Aggresome detection in aggregated proteins and aggresome‐like inclusion bodies in fixed and permeabilized samples, Abstract; Full Text
  7. Fibril growth and seeding capacity play key roles in α-synuclein-mediated apoptotic cell death: A.L. Mahul-Mellier, et al.; Cell Death Differ. 22, 2107 (2015), Abstract;
  8. In vitro administration of gold nanoparticles functionalized with MUC-1 protein fragment generates anticancer vaccine response via macrophage activation and polarization mechanism: T. Mocan, et al.; J. Cancer 6, 583 (2015), Application(s): Aggresome detection by fluorescence microscopy in peritoneal macrophages, Abstract; Full Text
  9. Intensified autophagy compromises the efficacy of radiotherapy against prostate cancer: M.I. Koukourakis, et al.; Biochem. Biophys. Res. Commun. 461, 268 (2015), Application(s): Fluorescence microscopy , Abstract;
  10. Mevalonate pathway regulates cell size homeostasis and proteostasis through autophagy: T.P. Miettinen, et al.; Cell Rep. 13, 2610 (2015), Application(s): Flow cytometry analysis of protein aggregation using Jurkat, U2OS, Kc167 and HUVEC cells, Abstract;
  11. MiR-29b replacement inhibits proteasomes and disrupts aggresome+autophagosome formation to enhance the antimyeloma benefit of bortezomib: S. Jagannathan, et al.; Leukemia 29, 727 (2015), Application(s): Detection of protein aggregates by fluorescence microscopy in multiple myeloma cell lines, Abstract; Full Text
  12. Molecular chaperone GRP78 enhances aggresome delivery to autophagosomes to promote drug resistance in multiple myeloma: M.A. Abdel Malek, et al.; Oncotarget 6, 3098 (2015), Application(s): Confocal Microscopy, Abstract; Full Text
  13. Pressure overload-induced cardiac dysfunction in aged male adiponectin knockout mice is associated with autophagy deficiency: J.W. Jahng, et al.; Endocrinology 156, 1667 (2015), Abstract;
  14. Protein kinase C-dependent growth-associated protein 43 phosphorylation regulates gephyrin aggregation at developing GABAergic synapses: C.Y. Wang, et al.; Mol. Cell. Biol. 35, 1712 (2015), Abstract;
  15. Schwann cells contribute to neurodegeneration in transthyretin amyloidosis: T. Murakami, et al.; J. Neurochem. 134, 66 (2015), Abstract;
  16. Cationic polystyrene nanospheres induce autophagic cell death through the induction of endoplasmic reticulum stress: H.W. Chiu, et al.; Nanoscale 7, 736 (2014), Abstract;
  17. Direct visualization of HIV-enhancing endogenous amyloid fibrils in human semen: S.M. Usmani, et al.; Nat. Commun. 5, 3508 (2014), Application: Amyloid detection in semen, Abstract;
  18. Distinct patterns of HSP30 and HSP70 degradation in Xenopus laevis A6 cells recovering from thermal stress: S. Khan, et al.; Comp. Biochem. Physiol. A Mol. Integr. Physiol. 168, 1 (2014), Application(s): Detection of aggresomes in Xenopus laevis cells using fluorescence microscopy, Abstract;
  19. Dynein function and protein clearance changes in tumor cells induced by a kunitz-type molecule, amblyomin-x: M.T. Pacheco, et al.; PLoS One 9, e111907 (2014), Application(s): Detection of aggresomes by flow cytometry, Abstract; Full Text
  20. Higher vulnerability and stress sensitivity of neuronal precursor cells carrying an alpha-synuclein gene triplication: A. Flierl, et al.; PLoS One 9, e112413 (2014), Application(s): Detection of protein aggregates by fluorescence microscopy and flow cytometry in neuronal precursor cells, Abstract; Full Text
  21. Human stefin B role in cell's response to misfolded proteins and autophagy: M. Polajnar, et al.; PLoS One 9, e102500 (2014), Application(s): Detection of protein aggregates in primary astrocytes, Abstract; Full Text
  22. Novel estradiol analogue induces apoptosis and autophagy in esophageal carcinoma cells: E. Wolmarans, et al.; Cell Mol. Biol. Lett. 19, 98 (2014), Abstract;
  23. Preconditioning stimulus of proteasome inhibitor enhances aggresome formation and autophagy in differentiated SH-SY5Y cells: Y. Bang, et al.; Neurosci. Lett. 566, 263 (2014), Abstract;
  24. Protein deubiquitination during oocyte maturation influences sperm function during fertilisation, antipolyspermy defense and embryo development: Y.J. Yi, et al.; Reprod. Fertil. Dev. (2014), Application(s): Detection of protein aggregates in oocytes, Abstract;
  25. Protein expression pattern of PAWP in bull spermatozoa is associated with sperm quality and fertility following artificial insemination: C.E. Kennedy, et al.; Mol. Reprod. Dev. 81, 436 (2014), Abstract;
  26. Serine/threonine kinase 16 and MAL2 regulate constitutive secretion of soluble cargo in hepatic cells: J.G. In, et al.; Biochem. J. 463, 201 (2014), Abstract;
  27. SGTA regulates the cytosolic quality control of hydrophobic substrates: L. Wunderley, et al.; J. Cell. Sci. 127, 4728 (2014), Application(s): Dual staining with ProteoStat® dye, Abstract; Full Text
  28. The small heat shock protein B8 (HSPB8) confers resistance to bortezomib by promoting autophagic removal of misfolded proteins in multiple myeloma cells: M. Hamouda, et al.; Oncotarget 5, 6252 (2014), Application(s): Analysis of velcade resistant multiple myeloma human cells by WB, Assay, Abstract; Full Text
  29. Aldosterone and angiotensin II induce protein aggregation in renal proximal tubules: M.U. Cheema, et al.; Physiol. Rep. 1, e00064 (2013), Application(s): Labeling of kidney homogenates, labeled particles sorted by flow cytometry and identification by LC-MS/MS , Abstract; Full Text
  30. Covalent and allosteric inhibitors of the ATPase VCP/p97 induce cancer cell death: P. Magnaghi, et al.; Nat. Chem. Biol. 9, 548 (2013), Application(s): Detection of aggresomes in human colon carcinoma HCT116 cells using fluorescence microscopy, Abstract;
  31. Environmental stresses induce misfolded protein aggregation in plant cells in a microtubule-dependent manner: Y. Nakajima, et al.; Int. J. Mol. Sci. 14, 7771 (2013), Application(s): Detection of aggresomes using fluorescence microscopy, Abstract; Full Text
  32. In vitro changes in mitochondrial potential, aggresome formation and caspase activity by a novel 17-β-estradiol analogue in breast adenocarcinoma cells: D.S. Nkandeu, et al.; Cell. Biochem. Funct. 31, 566 (2013), Abstract;
  33. Increased generation of cyclopentenone prostaglandins after brain ischemia and their role in aggregation of ubiquitinated proteins in neurons: H. Liu, et al.; Neurotox. Res. 24, 191 (2013), Abstract;
  34. Macrolide antibiotics block autophagy flux and sensitize to bortezomib via endoplasmic reticulum stress-mediated CHOP induction in myeloma cells: S. Moriya, et al.; Int. J. Oncol. 42, 1541 (2013), Application(s): Detection of aggresomes using flow cytometry, Abstract; Full Text
  35. Mst1 inhibits autophagy by promoting the interaction between Beclin1 and Bcl-2: Y. Maejima, et al.; Nat. Med. 19, 1478 (2013), Application(s): Detection of aggresomes in mouse heart sections using fluorescence microscopy, Abstract; Full Text
  36. N-terminally truncated forms of human cathepsin F accumulate in aggresome-like inclusions: B. Jeric, et al.; Biochim. Biophys. Acta 1833, 2254 (2013), Application(s): Detection of aggresomes using fluorescence microscopy, Abstract;
  37. The ubiquitin proteasome system regulates the stability and activity of the glucose sensor glucokinase in pancreatic beta cells: A. Hofmeister-Brix, et al.; Biochem. J. 456, 173 (2013), Abstract; Full Text
  38. VCP Phosphorylation-Dependent Interaction Partners Prevent Apoptosis in Helicobacter pylori-Infected Gastric Epithelial Cells: C.C. Yu, et al.; PLoS One 8, e55724 (2013), Application(s): Aggresome detection in AGS human gastric epithelial cells, Abstract; Full Text
  39. Zerumbone, an electrophilic sesquiterpene, induces cellular proteo-stress leading to activation of ubiquitin-proteasome system and autophagy: K. Ohnishi, et al.; BBRC 430, 616 (2013), Application(s): Aggresome detection in mouse hepatocytes, Abstract;
  40. Autophagy in idiopathic pulmonary fibrosis: A.S. Patel, et al.; PLoS One 7, e41394 (2012), Application(s): Detection of aggresomes in lung tissue sections using fluorescence microscopy, Abstract; Full Text
  41. Decreased proteasomal activity causes age-related phenotypes and promotes the development of metabolic abnormalities: U. Tomaru, et al.; Am. J. Pathol. 180, 963 (2012), Abstract;
  42. Mutations in the area composita protein αT-catenin are associated with arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy: J. van Hengel, et al.; Eur. Heart J. 34, 201 (2012), Abstract;
  43. Quantitative analysis of α-synuclein solubility in living cells using split GFP complementation: A. Kothawala, et al.; PLoS One 7, e43505 (2012), Application(s): Aggresome detection in HeLa cells, Abstract; Full Text
  44. Multiple aggregates and aggresomes of C-terminal truncated human αA-crystallins in mammalian cells and protection by αB-crystallin: I. Raju, et al.; PLoS One 6, e19876 (2011), Application(s): Aggresome detection in HeLa cells, Abstract; Full Text
  45. Novel Cell- and Tissue-Based Assays for Detecting Misfolded and Aggregated Protein Accumulation Within Aggresomes and Inclusion Bodies: D. Shen, et al.; Cell Biochem. Biophys. 60, 173 (2011), Abstract; Full Text

商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

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