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記事ID : 45555
研究用

ヒトTLR4レポーター HEK293細胞(NF-κB) HEK-Blue™ hTLR4 細胞

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HEK-Blue™ hTLR4細胞は、リポ多糖(LPS)の刺激に対するToll-like receptor 4(TLR4)依存性NF-κB応答を研究するために作製されたHEK293細胞株由来の細胞株です。TLR4とそのco-adaptorを介したLPSの認識は、NF-κBとIRFの活性化と、炎症性サイトカインとインターフェロンの産生につながります[1]。
TLR4シグナル伝達の詳細はコチラ

背景

Signaling pathways in HEK-Blue™ hTLR4 cells
図1 HEK-Blue™ hTLR4細胞のシグナル伝達図

HEK-Blue™ hTLR4細胞は、TLR4、アダプタータンパク質であるMD-2(myeloid differentiation factor 2)およびCD14(cluster of differentiation 14)の安定した発現を特徴としています。これらの細胞は、SEAP(分泌型胚性アルカリホスファターゼ)の誘導性レポーター遺伝子も発現します。TLR4依存性NF-κBが活性化した際に生成されるSEAPレベルは、SEAPのリアルタイム検出を可能にする細胞培養培地であるHEK-Blue™ Detectionでアッセイを行うことで容易に測定できます。または、SEAP検出試薬であるQUANTI-Blue™を使用してSEAP活性をモニターすることもできます。
HEK-Blue™ hTLR4細胞は、親細胞株であるHEK-Blue™ Null2外部リンクと比較して、平滑および粗い両方のタイプのLPSに対して強力なNF-κB応答を示します(図1)。
TLR4はNF-κBシグナル伝達経路とIRFシグナル伝達経路の両方を誘発するため、InvivoGen社ではNF-κB誘導性SEAPとIRF誘導性ルシアルシフェラーゼからなるデュアルレポーターシステムを発現する細胞株HEK-Dual™ hTLR4細胞外部リンクも提供しています。(詳細はこちら)。
尚、TLR3、TLR5、およびRIG-I様受容体を含むさまざまなPRRの内因性レベルを発現するHEK293細胞のため、類似したリガンドにも応答する可能性があります (図1)。

特長

  • ヒトTLR4、MD2、CD14を安定発現
  • R(Rough)型LPSとS(Smooth)型LPSに対する応答性の向上と再現性の向上
  • SEAP活性の評価によるTLR4依存性NF-κB活性化のモニタリング

アプリケーション

  • LPSによるサンプルコンタミネーションの検出
  • LPS誘導シグナル伝達経路におけるTLR4の役割の定義
  • TLR4アゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング
  • HEK-Blue™ hMD2-CD14(内因性TLR4発現なし)と併用した場合のTLR4の重要性の検証
参考文献
  1. Godowski, P., 2005. A smooth operator for LPS responses. Nat Immunol 6, 544–546.

商品データ

Response of HEK-Blue?-derived cells to TLR4 agonists
HEK-Blue™由来細胞のTLR4アゴニストに対する応答
HEK-Blue™ Null2、HEK-Blue™ hMD2-CD14及びHEK-Blue™ hTLR4細胞をHEK-Blue™検出試薬で培養し、10 ng/mLのTLR4アゴニスト、LPS-EB UP及びLPS-EK UPで24時間刺激した。ヒトTNF-α(1ng/mL)はNF-κBのポジティブコントロール。24時間のインキュベーション後、上清中のSEAPレベルを測定することにより、NF-κB誘導性SEAP活性を評価した。データは650 nmにおける吸光度(OD)として示した(平均値±SEM)。

Dose-response of HEK-Blue? hTLR4 cells to TLR4 agonists
TLR4アゴニストに対するHEK-Blue™hTLR4細胞の用量反応
細胞をHEK-Blue™検出試薬で培養し、LPS-EB UP、LPS-EK UP、MPLAs(合成)及びMPL-SM*(Salmonella minnesota R595由来MPL)の濃度を増加させて刺激した。24時間培養後、NF-κB誘導SEAP活性をOD:650 nmにて測定した(平均値±SEM)。

 
Response of HEK-Blue? hTLR4 cells to PRR agonists and cytokines
様々なPRRアゴニスト及びサイトカインに対するHEK-Blue™ hTLR4細胞の応答
細胞をHEK-Blue™検出試薬で培養し、サイトカイン及び種々のPRRアゴニスト:ヒトTNF-α(NF-κBのポジティブコントロール、1 ng/mL)、Pam3CSK4(TLR2リガンド、100 ng/mL)、ポリ(I:C)HMW(TLR3リガンド、100 ng/mL)、LPS-EK UP(TLR4リガンド、100 ng/mL)、CRX-527(合成TLR4リガンド、10 ng/mL)、FLA-ST UP(TLR5リガンド、10 ng/mL)、R848(TLR7/8リガンド、10µg/mL)、ODN2006(TLR9リガンド、10µg/mL)、Tri-DAP(NOD1リガンド、10µg/mL)及びMDP(NOD2リガンド、10µg/mL)で24時間刺激した。24時間のインキュベーション後、上清中のSEAPレベルを測定することにより、NF-κB誘導性SEAP活性を評価した。データは650 nmにおける吸光度(OD)として示した(平均値±SEM)。
NF-κB responses of HEK-Blue? hTLR4 vs. HEK-Dual? hTLR4
HEK-Blue™ hTLR4とHEK-Dual™ hTLR4のNF-κB応答
HEK-Blue™ hTLR4細胞およびHEK-Dual™ hTLR4細胞を、様々なTLR4アゴニスト; LPS-EB超純(UP)(1ng/mL)、LPS-EK UP(1ng/mL)、LPS-B5UP(100pg/mL)または合成MPLAs(100ng/mL)で刺激した。一晩インキュベートした後、QUANTI Blue™溶液を用いて上清中のSEAP活性を測定することにより、NF-κBの活性化を評価した。データは650 nmにおける吸光度(OD)として示した(平均値±SEM)。
 

仕様

  • 抗生物質耐性:Blasticidin, Hygromycin, Zeocin®
  • 増殖培地:DMEM, 4.5 g/l glucose, 2 mM L-glutamine, 10% (v/v) fetal bovine serum, 100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, 100 µg/ml Normocin™

 

構成内容

  • 3-7 x 106 cells
  • 250X HEK-Blue™ Selection(2 ml)
  • Normocin™ (50 mg/ml)
  • HEK-Blue™ Detection (cell culture medium for real-time detection of SEAP)
品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
HEK-BlueTM hTLR4 cells詳細データ ING HKB-HTLR4 1 VIAL
[3-7 x 10e6 cells]
¥376,000

【関連商品】

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HEK-BlueTM Null2 cells詳細データ ING HKB-NULL2 1 VIAL
[3-7 x 10e6 cells]
¥315,000
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[3-7 x 10e6 cells]
お問い合わせ

 

背景

TLR4シグナル伝達とは?

TLR4(Tall-like receptor4; トール様受容体4)は、最初に同定されたTLRであり、自然免疫および炎症における重要なパターン認識受容体(PRR)です。単球やマクロファージなどの自然免疫細胞の細胞表面とエンドソーム、および腸上皮細胞と内皮細胞にも存在します[1]。TLR4は、病原体および損傷に関連する分子パターン(PAMPおよびDAMP)を認識できます。しかし、それは主にリポ多糖類(LPS)とその有毒な部分である脂質Aによって活性化されます[2]。TLR4はLPSと直接相互作用しませんが、必須のアダプタータンパク質を必要とします[3]。可溶性LPS結合タンパク質(LBP)は、微生物膜からモノマーのLPSを抽出し、それをCD14に転送します。この膜結合タンパク質は、TLR4 エクトドメインと恒常的に関連する MD-2 (骨髄分化因子 2) と相互作用します。リガンドを有したMD-2はその後、別のTLR4/MD-2/LPS複合体に結合し、それらの二量体化を引き起こします[4]。その後、TLR4は2つの異なるシグナル伝達カスケードを誘発します[5]。

  • MyD88依存性活性化NF-κBパスウェイ(細胞表面)
  • TRIF依存性活性化IRFパスウェイ(エンドソーム内)
細胞表面では、TLR4の活性化によりTIRAP-MyD88依存性パスウェイが開始され、最終的にはNF-κBの活性化と炎症誘発性応答の産生につながります。また、TLR4 複合体は CD14 を介してエンドソームに取り込まれる可能性があります。その結果、IRF3(インターフェロン調節因子)が刺激され、I型IFNの発現が調節されます[3]。
TLR4シグナル伝達は急性および慢性の炎症性疾患の両方において非常に重要であり、そのため新しい治療法の研究ターゲットとして注目されています[1]。刺激薬剤はワクチンアジュバントやがん免疫療法の開発に有用である一方で、TLR4阻害は敗血症性ショックやアテローム性動脈硬化症などの自己免疫性炎症性疾患のターゲットとされています[5]。

R(Rough)型 LPS vs S(Smooth)型 LPS

LPSの構造の概要図

リポ多糖類(LPS)は、グラム陰性菌の外膜の主成分です。これは、共有結合で結合した3つの領域で構成されています。

  • 脂質A(エンドトキシン)
  • 粗い中心のオリゴ糖類
  • O抗原側鎖。
野生型 LPS には O 側鎖が含まれており、smooth (sLPS) と呼ばれます。いくつかの細菌株(例えば、 Salmonella Typhimurium, Brucella canis)はO側鎖を持ちません。この変異型はRough(rLPS)と呼ばれます。sLPS と rLPS はどちらも同じ受容体複合体 (TLR4-MD-2-CD14) を共有していますが、その作用機序は異なります。CD14 は sLPS NF-κB および IRF シグナル伝達には必要ですが、rLPS NF-κB シグナル伝達には必要ありません。rLPSはより広い範囲の細胞(CD14陽性、低、陰性)を活性化し、より高い毒性を説明するという仮説が立てられています[6]。 それにもかかわらず、両方の LPS 変異体は強力な自然免疫反応を引き起こします。結果として生じるシグナル伝達は、炎症性サイトカインの放出を引き起こし、急性および慢性炎症性疾患の両方につながる可能性があります。重要なのはバランスです。少量のLPSを制御すれば保護効果が得られますが、制御されていない大量のLPSは敗血症性ショックなどの結果につながる可能性も示唆されています[7]。LPSは炎症性が高いにもかかわらず、優れた治療の可能性を秘めており、効果的なワクチンアジュバントとして必要な多くの特性を備えています[8]。

 
参考文献
  1. Ou, T. et al. 2018. The Pathologic Role of Toll-Like Receptor 4 in Prostate Cancer. Front Immunol 9, 1188.
  2. Cochet, F. et al. 2017. The Role of Carbohydrates in the Lipopolysaccharide (LPS)/Toll-Like Receptor 4 (TLR4) Signalling. Int J Mol Sci 18
  3. Kuzmich, N.N. et al. 2017. TLR4 Signaling Pathway Modulators as Potential Therapeutics in Inflammation and Sepsis. Vaccines (Basel) 5.
  4. Tanimura N. et al. 2014. The attenuated inflammation of MPL is due to the lack of CD14-dependent tight dimerization of the TLR4/MD2 complex at the plasma membrane. Int Immunol.(6):307-14.
  5. Romerio A, Peri F. 2020. Increasing the Chemical Variety of Small-Molecule-Based TLR4 Modulators: An Overview. Front Immunol.;11:1210.
  6. Zanoni I,.et al., 2012. Similarities and differences of innate immune responses elicited by smooth and rough LPS. Immunol Lett. 2012 Feb 29;142(1-2):41-7.
  7. Godowski, P., 2005. A smooth operator for LPS responses. Nat Immunol 6, 544–546.
  8. McAleer, J.P. & Vella, A.T., 2010.  Educating CD4 T cells with vaccine adjuvants: lessons from lipopolysaccharide. Trends Immunol 31, 429-435.

商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

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