細胞内の活性型カスパーゼを測定 FLICA® 660 ポリカスパーゼアッセイキット（近赤外蛍光）

本キットは、生細胞や組織サンプルの活性型カスパーゼ酵素を標識する、新規近赤外蛍光カスパーゼ阻害剤プローブである、FLICA® 660-VAD-FMKを利用しています。蛍光顕微鏡を用いて蛍光シグナルを観察するか、フローサイトメトリーによりカスパーゼ活性を解析できます。

細胞透過性FLICAカスパーゼ検出プローブである660-VAD-FMKは、親和性阻害剤ペプチド配列（VAD）と、活性型カスパーゼ酵素と不可逆的な共有結合を形成するフルオロメチルケトン（FMK）残基で構成されます。この新規FLICAプローブは一般的な蛍光検出法で測定可能な、近赤外蛍光660色素レポーターで標識されています。

生細胞のカスパーゼ活性測定によるアポトーシスの検出

アポトーシスは、カスパーゼと呼ばれるタンパク質分解酵素のカスケードに関連する、進化的に保存された細胞の自殺形態です。アポトーシス促進シグナルは、タンパク質基質の切断を引き起こし、細胞の分解を生じさせる酵素カスケードを活性化させます。カスパーゼは、C. elegansからヒトに至るまでの生物で見出されています。アスパラギン酸特異的システインプロテアーゼである哺乳類カスパーゼファミリーの構成分子は、アポトーシスや炎症反応において特徴的な役割を有します。

• カスパーゼ
  活性型カスパーゼ酵素は、P1部位にアスパラギン酸を有するわずかテトラペプチドのアミノ酸配列を認識して特異的な基質とします。こうした親和性のあるテトラペプチドは、カスパーゼ結合と特異的に競合するペプチドを得るために使用されてきました。切断部位P1に特徴的なアスパラギン酸に加え、カスパーゼの活性部位との結合には、優れた特異性を決定する残基として、切断部位から左にP4までの4アミノ酸を要求します。テトラペプチドへフルオロメチルケトン（FMK）を付加すると、システインプロテアーゼ酵素と不可逆的に結合し、永久的に不活性化します。さらに、アミノ末端へ蛍光性の官能基を抱合することで、カスパーゼ活性を測定するプローブが得られます。
• FLICA™ カスパーゼ検出機構
  赤色FLICA® 660-VAD-FMKカスパーゼ検出プローブは、全活性型カスパーゼを標的とした高親和性ペプチド配列、近赤外蛍光性660色素標識とフルオロメチルケトン（FMK）活性部位で構成されています。蛍光性カスパーゼ阻害剤プローブにより、活性型カスパーゼ酵素と不可逆的な共有結合が形成され、効率的に標識、検出ができます。細胞透過性の性質と蛍光特性により、近赤外FLICAポリカスパーゼプローブは一般的な蛍光検出法を用いた細胞全体での解析に最適です。
  FLICAを使用するには、細胞懸濁液や組織の培地へ直接添加し、インキュベート、洗浄するだけです。細胞透過性のFLICA 660-VAD-FMK試薬は効率的に細胞内へと拡散、活性型カスパーゼ酵素と不可逆的に結合するので、カスパーゼ陽性細胞内で赤色シグナルが保持されます。FLICA® 660ポリカスパーゼプローブは660 nmでの励起、680〜690 nmでの蛍光検出が最適です。HeNe赤色633 nmレーザー光源で効果的に励起されるので、ほとんどのフローサイトメーターや、電子的なグレースケール画像機能を有する蛍光顕微鏡での解析が可能です。FLICA®試薬で標識した細胞はただちに測定するか、固定液を用いれば16時間は保持されます。

• ライセートではなく、生細胞をそのまま測定できる
• Ex/Em = 660 nm/680〜690 nm
• 蛍光顕微鏡やフローサイトメトリーで細胞そのまま分析可能
• 他の色素やプローブとマルチプレックスな固定ができる
• GFPや緑色自家蛍光に適合
• ベンチトップフロー適合

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