ゲノム編集実験の効率（変異導入効率）の確認に！ GeneCopoeia社 TALEN / CRISPR-Cas9 挿入欠損検出システム

本製品は、ゲノムDNA抽出を行うことなく細胞可溶化液を直接用いて標的ゲノム領域を増幅し、標的部位周辺におけるTALEN / CRISPR-Cas9 誘導性挿入欠損変異を検出する, 完全な挿入欠損検出システムです。標的部位PCRキットやT7エンドヌクレアーゼIアッセイキットをご用意しています。

ミスマッチ検出は、ゲノム編集研究においてTALEN あるいは CRISPR-Cas9の機能検証やノックアウトクローンスクリーニングの際に頻繁に使用される手法です。TALEN あるいは CRISPR-Cas9により期待した標的部位に導入された二本鎖切断（DSBs）は非相同性末端結合（NHEJ）による修復を受けますが、この修復は誤り(修復ミス)が起こりがちで、通常、DSB部位周辺に短鎖の挿入や欠損（挿入欠損）が生じます。標的領域をPCR増幅し、PCR産物を変性して再度アニーリングすると、ミスマッチが生じたDNAでは野生型／挿入欠損変異ミスマッチや挿入欠損変異1／挿入欠損変異2ミスマッチを形成します。再アニーリングしたPCR断片は、ミスマッチを含むDNAのみを認識し切断するT7エンドヌクレアーゼIとインキュベートします。期待した大きさの2本の短鎖バンドが得られた場合、TALEN あるいは CRISPR-Cas9により標的部位に挿入/欠損変異が導入されたと考えられます。挿入欠損候補のPCR断片は、クローニング後、配列決定を行い、さらに検証することができます。

図1．T7エンドヌクレアーゼIミスマッチ切断アッセイによるTALENまたはCRISPR機能検証

CRISPR-Cas9またはTALENを導入した細胞を、標的部位を挟んだ位置に設計したプライマーを用いてゲノムDNAより短鎖PCR産物を増幅した。PCR産物を変性後、再度アニーリングすることで、ミスマッチを含む二本鎖断片集団を形成させた。これらのミスマッチはT7エンドヌクレアーゼIの基質となる。CRISPR-Cas9またはTALENが細胞内で機能した場合、アガロースゲル上で切断産物を確認することができる。本ミスマッチ切断アッセイはCRISPR-Cas9 (sgRNA)やTALENのゲノム編集効率の検証や、さらに下流のスクリーニングに利用できる。

• CRISPR-Cas9またはTALENの機能検証やノックアウトクローンスクリーニングを簡便化
• 標的部位をロバストにPCR増幅！ゲノムDNA抽出の必要なし！
• 簡便化されたT7エンドヌクレアーゼIアッセイで条件や陽性コントロールが最適化済み

※　標的部位PCRプライマーはカスタム品として承っております。
下記、営業部までお問い合わせください。

図１．CRISPR-Cas9(sgRNA)により編集されたゲノム増幅物のT7エンドヌクレアーゼI処理

コントロール細胞(-)からは未切断増幅物の単一バンドのみが見られる。活性型CRISPR-Cas9(sgRN)をもつサンプル細胞(+)の増幅物からは、期待された大きさの未修正のバンドと切断後の2本のバンドからなる3本のバンドが見られる。

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