ELISpot・FluoroSpotのCytokine分泌に ポジティブコントロール：T細胞・B細胞

ELISpot や FluoroSpot アッセイのポジティブコントロールの調製に使用するペプチドや抗体製品です。T細胞やB細胞を活性化し、サイトカインやイムノグロブリンの分泌を誘発させる際にご利用ください。

細胞からのサイトカイン分泌の活性化には様々な物質が用いられ、モノクローナル抗体やペプチド、合成化合物、細菌・植物からの精製物質などによる刺激方法があります。ペプチドによる抗原特異的な刺激法や抗 CD3 抗体は、すでにその作用が明らかになっているため、多くの実験に用いられていますが、これらの刺激方法だけでは、全ての種のサイトカインを誘導することは出来ません。

ポジティブコントロールの細胞数は、スポットのカウントを容易にするために、多すぎないことが望ましいとされています。そのためウェルごとに添加する最適な細胞数を確立する必要があり、用いる刺激方法によって変動する可能性もあります。例えば、PHAのような刺激の場合にはウェルごとに40,000〜80,000個の細胞が最適とされていますが、CEF ペプチドプールまたはCEFTA ペプチドプールを用いた抗原刺激の場合には、より多い細胞数（約 250,000 個）が必要となります。
また、ポジティブコントロールウェルはリーダー設定の調整に利用できます。

CD3抗体

選択されたCD3抗体は、T細胞のポリクローナル活性化因子として使用することができます。マブテック社では、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13およびIL-17Aを含む多数のサイトカインの放出を誘発するヒトおよびサルCD3に対するモノクローナル抗体を提供いたします。in vitroで産生されたモノクローナル抗体ですので、ロット間のばらつきも低く抑えられています。

レクチン

フィトヘマグルチニン（PHA）およびコンカナバリンA（ConA）等のレクチンは強力なT細胞活性化因子として知られています。

図.1 精製したPBMCによるIFN-γサイトカイン分泌のELISpotアッセイ結果
細胞（50,000細胞/well）を、抗CD3（1：1000）の非存在下または存在下で20時間インキュベートし、IFN-γを分泌する細胞の数をELISpotで分析した。

特異的応答を誘導することが知られている抗原も、ポジティブコントロールとして有用です。ELISpotでの主な使用例は、抗原特異的ヒトCD8 + T細胞によるIFN-γ産生の検出で、この用途では抗原特異的なポジティブコントロールのCEFペプチドプールが開発されています。

CEFペプチドプールは、全白人人種の約90％においてヒトCD8 + T細胞を刺激し、IFN-γ応答を優先的に産生する23のウイルスペプチドで構成されています。 このペプチドは、様々なHLA型のドナーからT細胞を刺激するように設計されたCMV、EBVおよびインフルエンザウイルス由来のMHCクラスI拘束性T細胞エピトープを含みます。 それはまた、多くの個体からの細胞におけるパーフォリンおよびグランザイムB応答を誘発します。CEFペプチドプールは、ポジティブコントロールとして機能することに加えて、標準化にも有用です。

CEFTAペプチドプールは、ヒトCMVやEBV、インフルエンザウイルス、破傷風毒素、アデノウイルス5型のMCHクラスII型のウイルスペプチド（35種類）で構成されています。ヒトCD4+T細胞を刺激してIFN-γやIL-2、IL-5、IL-13を産出するため、ヒトPBMCを用いるELISpotやFluoroSpotアッセイのポジティブコントロールとしてお勧めです。また、フローサイトメトリーにも有用です。

図.2 ヒトIFN-γELISpotにおけるPBMCおよび分画T細胞のCEFペプチドプール刺激
ヒトPBMCは、CD4 +またはCD8 + T細胞が枯渇または濃縮されていた。 次に、CEFプールおよびIFN-γ分泌細胞を用いて細胞を刺激した。

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