短時間で、安く、低品質／微量RNAからも3'UTR次世代シーケンシング解析用のライブラリ作製！Lexogen社 QuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep Kit

本製品は、ポリアデニル化RNAの3'末端近郊配列をもつIllumina社機器およびIon Torrent™システムに対応する次世代シーケンシング解析用ライブラリを構築するキットです。

1 転写産物あたり1 分子の断片のみ逆転写されるため、シーケンス解析の際にリード数を抑えながら、mRNA の定量が可能です。

2種類の商品をご用意しております。

• QuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep Kit（FWD）；NGSリードがpoly(A)テールの方向に向かって産生され、mRNA配列を直接反映します。
• QuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep Kit（REV）；Illumina社機器用のみをご提供しています。本製品を用いると、NGSリードがpoly(A)テールより直接始まるためリード1の段階で3'末端（3'UTR）を正確に特定できます。しかし、クラスターコーリングを得るには、Multiplex Read 1 Sequencing Primerをカスタムシーケンシングプライマー（CSP：キットに含まれる）と置き換える必要があります。リード1中に得られるリードはcDNA配列を反映しています。

Ion Torrent™は、サーモフィッシャーサイエンティフィック社の登録商標です。

• 3' mRNA-Seqライブラリが4.5時間で作製可能
  シンプルなワークフローのため、4.5時間以内にシーケンシングに使用可能なライブラリを構築できます。このうち、作業時間は2時間以内です。
• 遺伝子発現と3'UTR解析におすすめ
• 低品質RNAやFFPEサンプルであっても100pgのtotal RNAインプットでライブラリ作製可能
  実験開始時に必要なtotal RNA量は最低100pg（Illumina社機器用製品）または5ng（Ion Torrent™システム用製品）です。本製品は、FFPEサンプルを含めた低品質RNAから再現性の高いライブラリを構築するのに適しています。
• 最大96サンプル／レーンで費用対効果の高いシーケンシング
  本製品は、高度なマルチプレックスを可能とします。Illumina社機器用QuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep Kitには、Illumina社機器のフローセルのレーンごとに、最大96サンプルをシーケンシングできる外付けバーコードが含まれています。Ion Torrent™用QuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep Kitには、Ion Torrent™機器での１回のシーケンシングで、最大48サンプルが配列決定できる直列型のバーコードが含まれています。QuantSeqにおける長さ制限がシーケンシングの空間節約となるため、この高度なマルチプレックスにより費用削減が可能となります。QuantSeqは、短鎖シーケンシングリード用の挿入配列が得られるようにデザインされています（SR50, SR100）。バーコードの詳細や使用方法の説明に関しては、製品マニュアルの23ページ目をご参照ください。
• 無料のデータ解析パイプライン「Bluebee®」をご用意
• Globin mRNA depletion Kit やマルチプレックス解析用i5/i7 インデックス、増幅バイアス確認用のバーコード（UMIs）と組み合わせてライブラリ作製可能

はじめに、oligo(dT) プライマーを用いてpoly(A) 特異的に逆転写反応を行います。次に、RNA の鋳型を除去し、ランダムプライミングにより第二鎖を合成します。インサート長はランダムプライマーの結合部位とpoly(A)tail の距離として求められます。続いて、バーコードを組み合わせてPCRを行います。イルミナ社シーケンサーの場合は最大9,216サンプル/ レーン、Ion Torrent™ システムの場合は最大48サンプル/ レーンでマルチプレックス化可能です。

■ QuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep Kit（FWD）

Forward（FWD）キットでは、第二鎖合成に使 用するプライマーにRead 1 リンカー配列を含むため（図1）、シーケンスリードはpoly(A)tailに向かって得られます。Forward（FWD）キットは遺伝子発現解析にお勧めです。

図.1 QuantSeq 3' mRNA-Seq FWD Kitのワークフロー
FWD Kit のRead 1 配列（緑）はmRNA の3'末端付近に対応するため、シーケンス解析時にサンプルあたりの総リード数を抑えることができる。

■ QuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep Kit（REV）

図.2 QuantSeq 3' mRNA-Seq REV Kitのワークフロー
REV Kit では、アダプター（Read 1 ならびにRead 2）の位置がFWD Kit とは反対になっており、転写終結点の正確な配列解析が可能である。REV Kit を用いてライブラリ作製した場合、REV Kit に含まれるCustom Sequencing Primer（CSP）を用いてRead 1 のシーケンス解析をする必要がある。

本製品は、高度なマルチプレックスを行うことで費用対効果の高い次世代シーケンシングを実現します。キットにはバーコードが含まれています。Illumina社機器用QuantSeqでは、PCR増幅ステップの際に標準外付けバーコードが導入され、フローセルのレーンごとに最大96サンプルまでシーケンシングすることができます。Ion Torrent™用QuantSeqでは、第二鎖合成ステップの際に最大48こが標準直列バーコードとして導入されます。

バーコードの詳細は使用方法の説明に関しては 製品マニュアルの24ページ目 をご参照ください。

QuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prepは、PerkinElmer社Sciclone NGSやHamilton社 Microlab STARのようなワークステーションを利用した自動化に対応するプロトコールをご用意しています。自動化には、Lexogen社WEBサイトより無料でダウンロードできる独自のソフトウェアを利用します。ライブラリ調製を自動化した場合には、ポリアデニル化RNAの3'末端付近の配列をもつ最大96種のIlluina社機器対応型ライブラリを使用する液体処理装置に応じて7〜8.5時間以内に作製できます。自動化には、試料トラッキングの誤りの回避、処理量の飛躍的な向上、手作業時間の短縮、といった利点があります。

* 本プロトコールは、Illumina社機器でのみ利用可能です。

• 短時間でライブラリ調製が完了
  使用する自動化装置によって異なりますが、手作業の時間を含め、全ライブラリ調製が約7時間（PerkinElmer社 Sciclone/Zephyr）または約8.5時間（Hamilton社 STAR）で完了します。プロトコールのステップによっては別個の機器でそれぞれ実行することも可能なため、ワークフローを並行処理することで処理時間をさらに短縮することも可能です。
• セットアップが簡単
  Lexogen社でご用意しているエクセルファイルに準じて、マスターミックス調製やプレート充填までの全行程を簡単にセットアップできます。
• 処理量が可変
  自動化プロトコールは、96種のバーコード付きライブラリ調製に適しています。PerkinElmer社Sciclone/Zephyr機器のプログラムでは、8反応の倍数のサンプル（全96ウェルプレート）を処理することができ、Hamilton社 STAR機器では、1〜48反応の任意の反応数を実行できます。1つのキットに含まれる試薬を複数機器に使用することもできます。
• 相互汚染の回避
  前段階のPCRステップとその後のPCR段階も異なる機器上でプログラムすることができるため、PCR産物とPCR前サンプルとの相互汚染の危険を実質的に回避することができます。

本キットのパフォーマンスは、コチラからご覧いただけます。

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