短時間で、安く、低品質／微量RNAからも3'UTR次世代シーケンシング解析用のライブラリー作製！Lexogen社 QuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep Kit

本製品は、ポリアデニル化RNAの3'末端近郊配列をもつIllumina社機器およびIon Torrent™システムに対応する次世代シーケンシング解析用ライブラリーを構築するキットです。

2種類の商品をご用意しており、QuantSeq 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit（FWD）は、NGSリードがpoly(A)テールの方向に向かって産生され、mRNA配列を直接反映します。QuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep Kit（REV）は、Illumina社機器用のみをご提供しています。本製品を用いると、NGSリードがpoly(A)テールより直接始まるためリード1の段階で3'末端（3'UTR）を正確に特定できます。しかし、クラスターコーリングを得るには、Multiplex Read 1 Sequencing Primerをカスタムシーケンシングプライマー（CSP：キットに含まれる）と置き換える必要があります。リード1中に得られるリードはcDNA配列を反映しています。

Ion Torrent™は、サーモフィッシャーサイエンティフィック社の登録商標です。

• 遺伝子発現と3'UTR解析用
• 低品質RNAやFFPEサンプルであっても100pgのtotal RNAインプットでライブラリー作製可能
  実験開始時に必要なtotal RNA量は最低100pg（Illumina社機器用製品）または5ng（Ion Torrent™システム用製品）です。本製品は、FFPEサンプルを含めた低品質RNAから再現性の高いライブラリーを構築するのに適しています。
• 最大96サンプル／レーンで費用対効果の高いシーケンシング
  本製品は、高度なマルチプレックスを可能とします。Illumina社機器用QuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep Kitには、Illumina社機器のフローセルのレーンごとに、最大96サンプルをシーケンシングできる外付けバーコードが含まれています。Ion Torrent™用QuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep Kitには、Ion Torrent™機器での１回のシーケンシングで、最大48サンプルが配列決定できる直列型のバーコードが含まれています。QuantSeqにおける長さ制限がシーケンシングの空間節約となるため、この高度なマルチプレックスにより費用削減が可能となります。QuantSeqは、短鎖シーケンシングリード用の挿入配列が得られるようにデザインされています（SR50, SR100）。バーコードの詳細や使用方法の説明に関しては、製品マニュアルの23ページ目をご参照ください。
• 3' mRNA-Seqライブラリーが4.5時間で作製可能
  シンプルなワークフローのため、4.5時間以内にシーケンシングに使用可能なライブラリーを構築できます。このうち、作業時間は2時間以内です。
• 高い鎖特異性
  QuantSeqは >99.9%といった類いまれな鎖特異性を保持し、リードをゲノムの対応する鎖にマップし、アンチセンス転写物や重複遺伝子の発見や定量を行うことができます。
• TES（Transcript End Site）のマッピングが可能
  poly(A) RNAの3'末端を正確に特定することができるため、3'UTRに関して的確な情報が得られます。
• 遺伝子計数に最適
  転写物ごとに1つの断片のみ産生されるため、長さの標準化を行う必要がありません。遺伝子発現値をより正確に決定できることから、遺伝子発現やeQTL研究においてマイクロアレイや従来型のRNA-Seqの代替法として最適です。
• バイオインフォマティクスによる分析が簡便化
  リードのマッピングは接合部検出を行わないことで簡便化しています。接合部がほぼ存在しない転写物の最も3'末端付近でリードを得るためです。データ処理は、例えばTopHat2ではなくBowtie2を利用することでスピードアップすることができます。

本製品は、シンプルで短いワークフローのため4.5時間以内にライブラリー構築を完了することができます。作業時間は、このうちの2時間以内です。キットではtotal RNAを初期試料として使用するため、事前にpoly(A)濃縮やrRNA除去を行う必要はありません。

• ステップ1：逆転写
  
  本キットでは初期試料としてtotal RNAを使用します。事前にpoly(A)濃縮やrRNA除去を行う必要はありません。
  
  ライブラリー構築の最初のステップとして、シーケンシング対応型リンカー配列をもつオリゴdTプライマーをプライミングさせます。
• ステップ2：RNA除去
  
  第一鎖合成後、鋳型RNAを除去。
• ステップ3：第二鎖合成
  
  ランダムプライミングとDNAポリメラーゼにより第二鎖合成が始まります。ランダムプライマーにはシーケンシングプラットフォーム対応型リンカー配列が含まれています。
  
  第一鎖合成と第二鎖合成間で精製を行う必要はありません。第二鎖合成の後、磁気ビーズを利用した精製を行い、自動化に対応させています。
• ステップ4：ライブラリー増幅
  
  ライブラリー増幅ステップ中に、Illumina社機器プラットフォームでのクラスター生成またはIon Torrent™プラットフォームでのコロニー形成に必要な配列が導入されます。
  
  Illumina社シーケンシングプラットフォームは最大96種の外付けバーコード、Ion Torrent™シーケンシングプラットフォームは24種の直列バーコードを用いてマルチプレックスを行うことができます。

本製品は、高度なマルチプレックスを行うことで費用対効果の高い次世代シーケンシングを実現します。キットにはバーコードが含まれています。Illumina社機器用QuantSeqでは、PCR増幅ステップの際に標準外付けバーコードが導入され、フローセルのレーンごとに最大96サンプルまでシーケンシングすることができます。Ion Torrent™用QuantSeqでは、第二鎖合成ステップの際に最大48こが標準直列バーコードとして導入されます。

バーコードの詳細は使用方法の説明に関しては 製品マニュアルの24ページ目 をご参照ください。

QuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prepは、PerkinElmer社Sciclone NGSやHamilton社 Microlab STARのようなワークステーションを利用した自動化に対応するプロトコールをご用意しています。自動化には、Lexogen社WEBサイトより無料でダウンロードできる独自のソフトウェアを利用します。ライブラリー調製を自動化した場合には、ポリアデニル化RNAの3'末端付近の配列をもつ最大96種のIlluina社機器対応型ライブラリーを使用する液体処理装置に応じて7〜8.5時間以内に作製できます。自動化には、試料トラッキングの誤りの回避、処理量の飛躍的な向上、手作業時間の短縮、といった利点があります。

* 本プロトコールは、Illumina社機器でのみ利用可能です。

• 短時間でライブラリー調製が完了
  使用する自動化装置によって異なりますが、手作業の時間を含め、全ライブラリー調製が約7時間（PerkinElmer社 Sciclone/Zephyr）または約8.5時間（Hamilton社 STAR）で完了します。プロトコールのステップによっては別個の機器でそれぞれ実行することも可能なため、ワークフローを並行処理することで処理時間をさらに短縮することも可能です。
• セットアップが簡単
  Lexogen社でご用意しているエクセルファイルに準じて、マスターミックス調製やプレート充填までの全行程を簡単にセットアップできます。
• 処理量が可変
  自動化プロトコールは、96種のバーコード付きライブラリー調製に適しています。PerkinElmer社Sciclone/Zephyr機器のプログラムでは、8反応の倍数のサンプル（全96ウェルプレート）を処理することができ、Hamilton社 STAR機器では、1〜48反応の任意の反応数を実行できます。1つのキットに含まれる試薬を複数機器に使用することもできます。
• 相互汚染の回避
  前段階のPCRステップとその後のPCR段階も異なる機器上でプログラムすることができるため、PCR産物とPCR前サンプルとの相互汚染の危険を実質的に回避することができます。

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