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Q&A

記事ID : 43499

Lexogen社 QuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep Kit

1. Lexogen社 QuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep Kit全般について

【1-01】 QuantSeq FWDとQuantSeq REVの違いは何ですか?

どちらのキットでも、mRNAの3'末端付近のcDNAが得られます。これらの違いは、Read1のリンカー配列の位置です。
FWDキットではRead1リンカー配列は第二鎖合成に使用するプライマーに組み込まれているため、シークエンスリードはpoly (A)尾部に向かって伸長します。QuantSeq FWDキットは遺伝子発現解析にお勧めです。

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図1 QuantSeq FWDのシークエンス時の読み取り方向

 

QuantSeq REVキットではRead 1リンカー配列が第一鎖合成に使用するoligo(dT)プライマーの5'末端に位置しているため、転写終結点付近の正確な配列解析が可能です。QuantSeq REVキットでは、3'末端を直接読み取るために、キットに含まれるカスタムシークエンスプライマー(CSP)を用いてRead 1のシークエンス解析を行う必要があります。

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図2 QuantSeq REVのシークエンス時の読み取り方向

 

【1-02】 QuantSeqは分解されているRNAやホルマリン固定パラフィン包埋(formalin-fixed paraffin-embedded:FFPE)試料からもライブラリを調製できますか?

はい、QuantSeq FWDキットおよびQuantSeq REVキットの両方で、低品質RNAやFFPE試料を使用可能ですが、一部、下記に示すようなプロトコールの変更が必要になります。

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FFPE組織由来のRNA試料では、RNAの品質のばらつきが大きく、RIN値の精度が低いため、RIN値に加えてDV200値(200塩基以上のRNA断片の割合)を測定して、RNAの品質をご確認いただくことを推奨しています。また、FFPE組織由来のRNA試料では、ライブラリ増幅時のアンダーサイクルやオーバーサイクルを防止するために、qPCRアッセイを行って、PCRのサイクル数を最適化することを推奨しています。特に、遺伝子発現を比較したい場合、qPCRアッセイを行ってそれぞれのライブラリの平均サイクル数を決定し、最終的に比較するすべてのライブラリのサイクル数を同じにする必要があります。

【1-03】 推奨のポジティブコントロールは何ですか?

すべてのQuantSeq製品でUniversal Human Reference RNA(アジレント・テクノロジー株式会社)をポジティブコントロールとして使用することを推奨しています。

【1-04】 QuantSeq のライブラリ調製において、もっとも重要な工程は何ですか?

QuantSeq FWD/REVのライブラリ調製で最も重要な工程は、第一鎖合成です。サンプルの温度を42℃に保つことで、oligo(dT)プライマーのpoly(A)尾部へのハイブリダイゼーションが確実になり、ミスハイブリダイゼーションを防ぐことができます。QuantSeqを初めてご使用される場合は、第一鎖合成のサポートビデオをご視聴いただくことを推奨しております。

【1-05】 QuantSeqのライブラリ調製にはどれくらいの時間がかかりますか?

4.5時間で total RNA から 3' mRNA-Seq ライブラリを調製可能です。QuantSeqを初めてご使用される場合、PCRのサイクル数を最適化していただく必要があり、qPCRを行う時間(約2.5時間)含め、余裕をもって実験を行っていただくことを推奨しております。また、実験前にUser Guideをご一読いただき、各試薬が正しく準備されていることを事前にご確認ください。

【1-06】 QuantSeq ライブラリ増幅のための推奨のPCRサイクル数はいくつですか?

最適なサイクル数は、サンプルタイプ(由来、組織、RNA品質等)によるため、qPCRアッセイで決定していただくことを推奨しておりますが、目安としてUniversal Human Reference RNA (UHRR)のインプット量と最適サイクル数(下記の表)をご参考ください。

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【1-07】 QuantSeqでは、どの程度のマルチプレックス化が可能ですか?QuantSeqで使用されているバーコード(インデックス)システムについて教えてください。

QuantSeqでは高度なマルチプレックスが可能です。インデックスはエンドポイントPCR中にバーコードとして導入されます。通常のQuantSeqには最大96個の6 nt i7インデックスが含まれています。Dual Indexをご希望の場合、4種類または96種類の6 nt i5インデックスが含まれる、別売りのLexogen i5 6 nt Unique Dual Indexing Add-on Kitを組み合わせることで、最大9216種類のバーコードを使用することができます。

Unique Dual Index (UDI) でインデックスホッピングの影響を抑えたい場合は、最大384種類のpre-mixed UDIsが含まれる、別売りのLexogen UDI 12 nt Unique Dual Indexing Add-on Kitを組み合わせることで、インデックスエラーを修正することができます。また、最大384種類の12 nt UDIがあらかじめ含まれているQuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep Kit (FWD) with UDI 12 ntのご用意もございます。

【1-08】 QuantSeq と互換性のあるDual Indexing Kitはどれですか?

QuantSeq-FWD, QuantSeq-REV, QuantSeq-Flex, QuantSeq-Pool ライブラリ調製キットは下記のDual Indexing Kitと互換性があります。

品番 品名 包装
UDI 12 nt Unique Dual Indexing Add-on Kits contain primer plates and PCR Enzyme and PCR Buffer
107.96 Lexogen UDI 12 nt Unique Dual Indexing Add-on Kit, Set A1 (UDI12A_0001-0096), 1 rxn/UDI 96 PREP.
108.96 Lexogen UDI 12 nt Unique Dual Indexing Add-on Kit, Set A2 (UDI12A_0097-0192), 1 rxn/UDI 96 PREP.
109.96 Lexogen UDI 12 nt Unique Dual Indexing Add-on Kit, Set A3 (UDI12A_0193-0288), 1 rxn/UDI 96 PREP.
110.96 Lexogen UDI 12 nt Unique Dual Indexing Add-on Kit, Set A4 (UDI12A_0289-0384), 1 rxn/UDI 96 PREP.
111.96 Lexogen UDI 12 nt Unique Dual Indexing Add-on Kit, Set B1 (UDI12B_0001-0096), 1 rxn/UDI 96 PREP.
120.96 Lexogen UDI 12 nt Unique Dual Indexing Add-on Kit, Sets A1-A4 (UDI12A_0001-0384), 1 rxn/UDI 384 PREP.
i5 6 nt Indexing Add-on Kits
047.4x96 Lexogen i5 6 nt Dual Indexing Add-on Kit (5001-5004), 96 rxn/Index 96 PREP.
47.96 Lexogen i5 6 nt Unique Dual Indexing Add-on Kit (5001-5096), 1 rxn/Index 96 PREP.

【1-09】 Lexogen UDI 12 nt Unique Dual Indexing Add-on KitによるDual PCRとQuantSeq FWD/REVで提供されているPCR Mixの違いについて教えてください。

QuantSeq FWD/REVで提供されているPCR Mixには、インデックスの無いP5プライマーが含まれています。そのため、このPCR Mixをi5およびi7インデックスプライマーと一緒に使用すると、最終的に得られたライブラリにはi5インデックスを持たないインサート断片が一部存在することになります。このリードはdemultiplexing中に失われます。12 nt UDIを使用する場合は、QuantSeq 3' mRNA-Seq FWD with UDI 12 nt KitsのUser Guide(113UG227)に記載されている、Endpoint PCR プロトコールに従ってください。

【1-10】 ライブラリのサイクル数が足らなかった(アンダーサイクルとなった)場合の対処法を教えてください。

大抵、アンダーサイクルとなってしまったライブラリでもプーリングとシークエンスに十分な量のcDNAが含まれているため、再度PCRを行う必要はありません。ライブラリの量がシークエンスに十分かどうかは、Lexogen社のライブラリ定量計算ファイルで確認できます。
このファイルに測定した濃度を入力し、プールする各ライブラリの量を調節します(最小量は10 fmol)。プールに必要な量がアンダーサイクルで得られたライブラリのcDNAの量を下回っていれば、ライブラリはシークエンス可能です。シークエンスに十分な量が得られなかった場合、別売りのPCR Add-on Kit for Illumina, 96 rxn(品番:020.96)に含まれる再増幅プライマーを使用してPCRを行う必要があります。PCR Add-on Kit for Illumina, 96 rxnは、single indexライブラリにのみ使用できる点ご注意ください。dual indexライブラリは別売りのReamplification Add-on Kit for Illumina(品番:080.96)でのみ再増幅が可能です。

【1-11】 ライブラリのサイクル数が多すぎた(オーバーサイクルとなった)場合の対処法を教えてください。

バイオアナライザートレースにおけるベースラインの上昇(下記図参照)や、1000〜9000 bpにあるセカンドピークはオーバーサイクルの兆候です。

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図3 適切なサイクル(10 ng UHRR, 19 cycles,青)とオーバーサイクル(10 ng, 24 cycles,赤)で作製したQuantSeqライブラリのバイオアナライザートレース

 

オーバーサイクルの原因は、ライブラリ増幅のPCRサイクル数が多すぎて、PCRでプライマーとテンプレートが枯渇し、生成された二本鎖cDNAが変性し始め、誤って再アニーリングされてしまった際に生じます。これにより、バイオアナライザーチップやゲル上を低速で流れる長くて大きな分子が生成され、バイオアナライザーだけではライブラリの正確な定量ができなくなってしまいます。
オーバーサイクルが疑われるライブラリを正確に定量するには、バイオアナライザーまたは同様の分析に加えて、qPCRアッセイを行う必要があります。発現データの偏りを無くすための最善の方法は、ライブラリを再調製し、ライブラリの増幅時のPCRサイクル数を減らす方法です。ライブラリの再調製が難しい場合(貴重なサンプルなど)は、オーバーサイクルによりPCR duplicates が多くなり、定量精度やクラスター分析に影響を与える可能性があるものの、シークエンスのステップに進むのが最善です。
オーバーサイクルを防ぐには、qPCRアッセイを行ってライブラリ生成に必要な最適なPCRサイクル数を決定する必要があります。同じようなサンプルであれば、ライブラリ増幅(エンドポイントPCR)のPCRサイクル数を減らすことでオーバーサイクルを防ぐことができます。オーバーサイクルライブラリの収量に応じて減らすべきサイクル数は下記を参考に決定してください。

半分の収量に減らしたい場合 1サイクル
4分の1の収量に減らしたい場合 2サイクル
10分の1の収量に減らしたい場合 3サイクル

【1-12】 バイオアナライザートレースでupper makerより大きなサイズの位置にあるピークは何を意味していますか?

upper makerより大きいサイズの位置で見られるベースラインの上昇は、オーバーサイクルを示している可能性があります(詳細はQ【1-11】をご確認ください)。 または、精製ビーズの混入(ビーズのキャリーオーバー)が原因で、upper maker周辺やそれより大きな位置にピークが生じる可能性があります。ビーズのキャリーオーバーを防ぐために、溶出液を回収する際は、サンプルをマグネット上において、5分ほどインキュベートした後、ビーズに溶出液を2 µlほど残すようにしてください。サンプル全量を回収しないように、15〜17 µlのみを新しいPCRプレートまたはチューブに移してください。

【1-13】 QuantSeqライブラリの一般的なフラグメントサイズはどれくらいですか?

QuantSeqのプロトコールは、短いリード(SR75〜100)用に最適化されており、平均ライブラリサイズはおよそ335〜456 bp、平均インサートサイズは203〜324 bpです。別売りのQuantSeq-Flex First Strand Synthesis Module V2 for Illumina(品番:166.96)をQuantSeqと一緒に用いることで、QuantSeqライブラリのリード長を延長することができます。詳細についてはUser Guideをご確認ください。

【1-14】 得られたQuantSeqデータは、データ解析パイプラインBlueBee®で解析できますか?

すべてのQuantSeq FWD/REVキットには、無料のデータ解析パイプラインBlueBee®にアクセスするためのコードが付属しています。提供されるパイプラインはキットのPREP数分だけ含まれています。例えば96 PREPのキットの場合、96 PREP分のデータ解析を実行できます。BlueBee®で解析可能な適応種は、こちらをご確認ください。

QuantSeq FWD/REVキットに含まれている無料のBlueBeeRコードは、最大1.5 GBまでのFASTQファイルに対応しています。それ以上の大きいサイズのデータを解析したい場合は、ファイルを圧縮するか、大きなサイズのファイルに対応したBlueBeeRコードを別途ご購入いただく必要がございます。これらの詳細についてはこちらをご参照ください。

QuantSeq FWDで提供されるコードには、下記の2種類のパイプラインオプションがございます。

  • FWD pipeline:標準のQuantSeq FWDライブラリデータ用
  • FWD-UMI pipeline:別売りのUMI Second Strand Synthesis Module for QuantSeq FWD for Illumina(品番:081.96)を使用して作成されたQuantSeq FWDライブラリ専用
ライブラリ作成方法に応じてどちらかを選択する必要があり、両方のパイプラインオプションを実行したい場合は追加でコードを購入していただく必要があります。UMIを含まないライブラリに対してFWD-UMI pipelineを選択してしまうと、リードが不適切に折りたたまれ、リード数が誤って認識されてしまうため、UMIを含まないライブラリには、FWD pipelineを選択してください。間違ったパイプラインオプションを選択し、解析を開始してしまった場合、実行が完了する前に中止することができますが、実行が完了してしまった場合は追加のパイプラインをご購入いただく必要がございます。また、FWDライブラリの解析にQuantSeq REVに付属のコードは使用できませんのでご注意ください。

【1-15】 QuantSeqに含まれているデータ解析パイプラインBlueBee®のコードはどこにありますか?

すべてのQuantSeq FWD/REVキットにはBlueBee®のアクティベーションコードが付属しています。このコードはメインのQuantSeqキットのボックスに入っている小さな試薬ボックスの側面に貼られたステッカーに印刷されています。

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QuantSeq FWD with UDI kitsでは、Library Generation Module試薬ボックス内のカードにアクティベーションコードが記載されています。

 

【1-16】 QuantSeqのデータ解析にマイコプラズマはどのような影響を及ぼしますか?

マイコプラズマRNAがQuantSeqライブラリ調製のインプットとして使用されるサンプルに存在する場合、全体的なマッピング率が低下して、標的遺伝子における特異的なマッピング率が低下してしまいます。最悪な場合は30%以下のマッピング率になることがあります。また、リードをマイコプラズマにマッピングすると、固有のマッピングリードを特定することができます。異なるマイコプラズマ種が存在している可能性があるため、BLASTnを使用してシークエンスを確認してください。

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2. Lexogen社 QuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep (FWD)について

【2-01】 QuantSeq FWD HT kit(品番:015.384)は、通常のQuantSeq FWD kitと何が違うのでしょうか?

QuantSeq FWD HT kit(品番:015.384)は、96種類のi7インデックスを含む標準のQuantSeq FWD kitに、4種類のi5インデックスが追加され、最大384種類のライブラリ調製が可能な高い処理能力を備えたキットです(high-throughput version:HT)。index hoppingを押さえたい場合は、あらかじめ384種類のUnique Dual Index(UDI)を含む、QuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep Kit FWD with UDI 12 nt Sets A1-A4(品番:115.384)がお勧めです。

【2-02】 QuantSeq FWDライブラリに最適なシークエンスのリード長はどれくらいですか?

ほとんどのアプリケーションにおいて、single-read 50 bp (SR50) または single-read 75 bp (SR75) で十分です。ライブラリにUnique Molecular Indentifiers(UMI)が含まれている場合は、推奨の最小リード長はSR75 です。 また、ゲノム配列の1か所にのみマッピングされるリード(ユニークマッピングリード)を増したい場合や、poly(A)尾部まで読み取ることで3'末端の配列を正確に解析したい場合は、より長いリード長(SR100, SR150)が適用可能です。

【2-03】 QuantSeq FWDに必要なRNAのインプット量はどれくらいですか?

サンプル中に含まれるpoly(A)RNAの含有量に依りますが、推奨のRNAインプット量は1〜500 ngです。(total RNAのインプット量が10 ng未満の場合は一部プロトコールの修正が必要です。(Q【2-04】 参照)total RNAのpoly(A)濃縮や、rRNA除去は必要なく、FFPE組織由来のRNAのような、低品質のRNAもご使用いただけます。低発現量の転写産物を効率的に検出するためには、200 ng以上のインプット量を推奨しており、最初はtotal RNAのインプット量を500 ngでお試しいただくことをお勧めいたします。

【2-04】 QuantSeq FWDの最低インプット量はどれくらいですか?また、インプット量が少ない場合、プロトコールに変更点はありますか?

インプット量が1 ng未満でも機能しますが、10 ng以下のインプット量で実験する場合は、total RNAのインプット量に応じて、下記のプロトコールの変更が必要です。

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【2-05】 インサートサイズを長くする方法はありますか?

QuantSeq FWDと併せて、別売りのQuantSeq-Flex First Strand Synthesis Module(品番:166.96)をご使用いただくことで、より長いインサートサイズを持つライブラリが調製可能です。手順の詳細については、当該商品のUser Guideをご確認ください。

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図4 QuantSeq-Flex First Strand Synthesis Moduleを用いて得られた、より長いインサートサイズのライブラリの例
標準のQuantSeq(赤色、RNA+dT)およびQuantSeq-Flex(青色、std.)を用いてUniversal Human Reference RNA(UHRR)500 ngから得られたサンプルのバイオアナライザートレースを示した。インプットRNAは標準のQuantSeqのFS1 bufferまたはQuantSeq-Flexの5 µl oligo(dT)を用いて85℃で3分間変性させた。RNA+dT条件下では、平均ライブラリサイズが増大する。ライブラリはi7およびi5のインデックスプライマーを用いて、Lexogen i5 6 nt Dual Indexing Add-on Kit(品番:047.4X96、047.96)に含まれるDual PCR Mixでサイクル数:13で増幅した。

 

【2-06】 QuantSeq FWDライブラリに適したシークエンスプラットフォームは何ですか?

QuantSeq FWDキットは、下記のIllumina社機器でのシークエンス解析に適しています。

  • GAIIX
  • iSeq 100
  • HiSeq 2000/2500/3000/4000
  • MiSeq
  • NextSeq 500/550/2000
  • MiniSeq
  • NovaSeq

【2-07】 QuantSeq FWDライブラリでペアエンドシークエンスは可能ですか?

QuantSeq FWDライブラリにおけるRead 2は伸長開始時にpoly(T)配列があるため品質が非常に低く、ペアエンドシークエンスは推奨しません。もし、ペアエンドシークエンスモードでシークエンス処理をした場合は、Read 2のデータは破棄し、その後の解析にはRead 1のみを用いるようにしてください。ペアエンドシークエンスにはQuantSeq REVを推奨しております。

【2-08】 QuantSeq FWDのリードのシークエンスの読み取り方向は?

QuantSeq FWDのリードは1 転写産物あたり 1分子の断片のみ逆転写されます。そのため、QuantSeq FWDでは主に3'末端付近を解析し、Read 1の配列はmRNAの配列を直接反映しています。

【2-09】 トリミングのステップでは何をトリミングするべきですか?

QuantSeqのシークエンスリードでは、アダプター配列、poly(A) / poly(T)配列、および低品質ヌクレオチドを除去する必要があります。また、短すぎるリード(<20 nt)、または低品質なリードも、アラインメントの前に除去する必要があります。第二鎖合成ステップはランダムプライミング法に基づいているため、ランダムプライマーがcDNAへ非特異的にハイブリダイゼーションし、インサートの最初のヌクレオチドのエラーが起こりやすくなります。そのため、QuantSeq FWDのデータの場合、アラインメント中にリードエンドのsoft-clippingが実行できる、STAR alignerのようなアラインメントツールを用いて、許容ミスマッチ数を14まで増やすことを推奨しております。あるいは、HISAT 2のような、より厳密なアラインメントツールを使用する場合、アラインメントの前にRead 1の最初の12 ntをトリミングすることを推奨いたします。リードをトリミングすると、アラインメントに適した長さのリード数を減らすことができますが、リードの品質向上によりマッピングリードの絶対数が増加する可能性があります。

【2-10】 QuantSeq FWDのデータ解析に推奨されるアラインメントツールは何ですか?

QuantSeq FWDデータのマッピングにはSTAR alignerを推奨しています。リードは最後のエクソン部位に到達せず、連結部分をまたぐこともあります。STAR alignerでは、アラインメント中にリード端のsoft-clippingを実行できるため、アラインメント率を最大限に高めることができ、アラインメント前に追加の5'ヌクレオチドをトリミングする必要がなくなります。ただし、poly(A)尾部とシークエンスアダプタを除去するには、アラインメントの前に必ずリードのトリミングが必要です(Q【09】参照) 。

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3. Lexogen社 QuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep Kit (REV)について

【3-01】 QuantSeq FWDとQuantSeq REVの違いは何ですか?QuantSeq REVが必要なのはどのような場合ですか?

どちらのキットでも、mRNAの3'末端付近のcDNAが得られます。これらの違いは、Read1のリンカー配列の位置です。QuantSeq REVではRead 1リンカー配列が、oligo(dT)プライマーの5'末端に位置し、Read 2リンカー配列が第2鎖合成中に使用されるランダムプライマーの5'末端に位置しているため、QuantSeq FWDとは逆方向のライブラリが生成されます。

FWDキットではRead1リンカー配列は第二鎖合成に使用するプライマーに組み込まれているため、シークエンスリードはpoly(A)尾部に向かって伸長します。FWDキットは遺伝子発現解析にお勧めです。

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キットに含まれるカスタムシークエンスプライマー(CSP)は、Read 1の開始時にpoly(T)伸長シークエンスを避けるために、QuantSeq REVライブラリのシークエンスに必要で、これによりRead 1が正確に転写産物の3'末端から開始されます。
QuantSeq REVではペアエンドシークエンスで3'UTRアイソフォームを同定するのに有効で、選択的ポリアデニル化部位の同定や、3'UTRアイソフォーム発現研究などにお勧めです。

【3-02】 QuantSeq REVに必要なRNAのインプット量はどれくらいですか?

推奨のtotal RNAインプット量は、10〜500 ngです。QuantSeq FWDとは異なり、最小インプット量は10 ngで、低インプット量に対応したプロトコールは適用できません。また、total RNAのPoly(A)濃縮やrRNA除去は必要ありません。

QuantSeqに必要なtotal RNA量はサンプルにおけるpoly(A)RNA含有量によって異なります。Lexogen社では様々な培養細胞、動物や植物組織、酵母、真菌、ショウジョウバエ、およびヒトReference RNAにて検証済です。低量の転写産物を効率的に検出するためには、200 ng以上のインプットRNAが推奨されるため、最初は、500 ngのtotal RNAでお試しいただくことを推奨しています。インプット量に限りがある場合は、より長いシークエンスリード長をご選択いただくことで、3'末端の読み取りも可能ですので、QuantSeq FWDをお試しいただくことを推奨いたします。

【3-03】 QuantSeq REVでのライブラリ調製にUMI Second Strand Synthesis Module(品番:081.96)を一緒に使用することはできますか?

UMI Second Strand Synthesis Module(品番:081.96)はQuantSeq FWD のみに対応しているため、QuantSeq REVではご使用いただけません。UMI Moduleに含まれる、UMIを持つランダムプライマーに、QuantSeq REVで使用されるoligo(dT)プライマーのP5アダプター配列が含まれるため、QuantSeq REVでUMI Moduleを使用しても、P7アダプターが無く、適切なライブラリができません。

【3-04】 QuantSeq REVライブラリに適したシークエンスプラットフォームは何ですか?

QuantSeq REVでは、Read 1の配列決定にカスタムシークエンスプライマー(CSP)を必要とするため、CSPが適用可能なすべてのIlluminaプラットフォームでシークエンス可能です。これらのプラットフォームとして、NextSeq 500/550および、NextSeq 2000、HiSeq 2000/2500/3000/4000、NovaSeq 6000、MiSeq計測器が含まれます。QuantSeq REVライブラリはCSPに対応していないiSeq 100とは互換性がありません。

【3-05】 カスタムシークエンスプライマー(CSP)の使い方について教えてください。

QuantSeq REVで提供されている、CSP Version 5 (CSPV5)は、poly(T)伸長部位をカバーし、Multiplex Read 1 Sequencing Primerとして機能します。 各Illumina機器におけるCSPV5の正しい使用方法については、こちらをご参考ください。なお、iSeq 100では、CSPV5は使用できません。

【3-06】 QuantSeq REVに適したシークエンスのリード長はどれくらいですか?

QuantSeq REVのシークエンスでは、single-read 75-150 bp(SR75〜150)で読み取ることが好ましく、読み取りは正確に3'UTRから始まるため、読み取りの最初は転写産物の末端から25 ntまでをカバーするポリアデニル化シグナル部位を含んでいます。 ポリアデニル化シグナルは全ての転写産物で非常に類似しているため、より長いリードほど、ユニークマッピングの比率が高くなります。

【3-07】 QuantSeq REVライブラリでペアエンドシーケンシングはできますか?

はい、QuantSeq REVではペアエンドシーケンシングが実行可能です。QuantSeq REVでは転写産物における3'末端の正確な読み取りの為に、Read 1用のカスタムシークエンスプライマー(CSP)が必要です。

【3-08】 QuantSeq REVのデータにpoly(T)伸長部位があり、シークエンスの品質が低いのですが、この理由を教えてください。

考えられる理由として下記の2つが挙げられます。

  • Read 1のシークエンスにカスタムシークエンスプライマーVersion 5(CSPV5)を使用していない。
    CSPV5を使用しないと、Read 1の開始時にpoly(T)伸長が行われ、読み取りの精度と実行結果が損なわれます。ご使用のシーケンシング機器が、CSPに対応していることをご確認いただき、こちらから、正しい手順でCSPが使用されていることをご確認ください。
  • ライブラリ調製中における、第一鎖合成中にoligo(dT)プライマーがミスハイブリダイゼーションした。
    ライブラリ調製時に、サンプルを42℃に維持していないと、oligo(dT)プライマーがミスハイブリダイゼーションしてしまう恐れがあります。これにより、インサートの短いライブラリが転写産物のpoly(A)尾部にさらにプライミングされてしまい、CSPV5を使用しているにも関わらず、Read 1の開始時に長いpoly(T)伸長部位を持つリードが発生する可能性があります。ライブラリ調製時のミスハイブリダイゼーションを防ぐための、第一鎖合成の注意事項については第一鎖合成のサポートビデオを参照ください。

【3-09】 トリミングのステップでは何をトリミングするべきですか?

QuantSeq REVを用いて行ったシングルリードシークエンスではトリミングの必要はありませんが、ペアエンドシーケンシングでは、Read 2の最初の12ヌクレオチドのトリミングが必要です。別の方法としては、STAR alignerを使用して、許容ミスマッチ数を16に設定することを推奨しております。アダプターの混入を検出する場合、リードをアラインメントするためにcutadaptやtrim-gallore、bbdukなどでトリミングしていただくことを推奨しています。

【3-10】 QuantSeq REVのデータ解析に推奨されるアラインメントールは何ですか?

QuantSeq REVデータのマッピングにはSTAR alignerを推奨しています。リードは最後のエクソン部位に到達せず、連結部分をまたぐこともあります。poly(A)尾部とシークエンスアダプタを削除するには、アラインメントの前に必ずリードのトリミングが必要です。QuantSeq REVのデータ分析の詳細については、こちらをご参考ください。

【3-11】 QuantSeq REVのシークエンスの読み取り方向は?

Read 1の読み取りは、poly(A)尾部から開始し、転写配列を再び読み取ってcDNA配列を反映します。そのため、Read 2はmRNAの配列を直接反映し、poly(A)尾部に向かって転写されます。

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