AAVS1(ヒト）、ROSA26（マウス）に標的遺伝子をノックイン GeneCopoeia社 CRISPR-Cas9 遺伝子ノックインキット & HDR ノックインクローン

CRISPR-Cas9をはじめとしたゲノム編集技術は、対象遺伝子やほかの遺伝要素を染色体上の特定部位に挿入することができ、細胞工学においても非常に有益です。遺伝的に修正された細胞は系譜追跡や分析(genetic lineage tracing)と同様に創薬研究や遺伝子機能研究においても有用です。これらのアプリケーションは内在性遺伝子やほかの制御要素にかきみだされることなく、導入遺伝子の機能が想定どおりであることや、その信頼性に左右されます。一方で、導入遺伝子の無作為な組込みは予期しない挿入や変異を誘発する恐れがあります。

近年開発された新しいアプローチに、予め決定しているゲノム内の安全な部位に導入遺伝子を送達するという手法があります。マウスゲノムのROSA26と同様にヒト染色体第19位のAAVS1（PPP1R2C座位としても知られる）は、既知機能をもつDNA断片を宿す上で非常によく検証された「セーフ・ハーバー（安全地帯）」座位です。この領域はopen chromatin structureを取り、転写競合性です。また、希望するDNA断片を挿入しても細胞に悪影響を及ぼすことがこれまで報告されていない、という点は特記すべきでことです。

部位特異的CRISPR-Cas9システムはゲノム上のセーフ・ハーバー座位にDNA二本鎖切断（DSBs）を導入することができ、天然のDNA修復機構を刺激します。関連するORFノックインクローンが存在する場合、相同性組換え（HR, HDR）が生じORFノックインクローンよりDNA断片がセーフ・ハーバー座位へ組込まれます。

図1．CRISPR-Cas9 媒介型のセーフ・ハーバーへの導入遺伝子組込み

• セーフ・ハーバー部位への目的遺伝子組込み用ゲノム編集ツール 実験検証
• ドナーを利用した効果的なゲノム編集アプリケーション

• 安全な組込み
  セーフ・ハーバー組込み部位により導入遺伝子の転写適格性が確実！さらに既知の有害効果なし！ 
• 特異的標的
  ゲノム編集ツール介在型のセーフ・ハーバー部位における二本鎖切断(DSBs)により転写遺伝子組込みの相同性組換えを劇的に刺激
• 生理的水準の発現
  既知のセーフ・ハーバー部位における組込みにより導入遺伝子のコピー数が低く抑えられ、生理的水準の発現が可能となるため、表現型の解釈が容易
• 互換性のあるノックインORF
  20,000種以上の配列検証済みヒトORFクローンおよび20,000種以上のマウスORFクローンが導入遺伝子ドナーDNAデザインと互換性あり

AAVS1は、PPP1R2C座位としても知られる領域で、ヒト第19染色体上に位置しています。この領域は期待する機能を損なうことなくDNA導入遺伝子の宿主となり得ることが検証済みの「セーフ・ハーバー（安全地帯）」です。開放型クロマチン構造をとり、転写競合性です。このAAVS1座位は、これまで対象DNA断片の挿入による細胞への有害作用が報告されておらず、これは非常に重要なポイントです。AAVS1特異的なCRISPR-Cas9 sgRNAを用いることで、AAVS1座位に二本鎖切断（DSBs）を導入し、DNA修復を刺激することができます。また、AAVS1 ORFノックインクローンを同時に用いることで、相同組換え（HR）が生じセーフ・ハーバー座位にORFをノックインすることができます。

本キットは、CRISPR-Cas9介在型相同組換えを利用して対象遺伝子、選択マーカー、または他の遺伝要素をヒト第19染色体上のAAVS1セーフ・ハーバー部位に特異的に導入できるようデザインされており、AAVS1 sgRNA/Cas9発現クローン、ドナークローニングベクターまたはドナークローン*1、ポジティブクローン、およびノックインPCR検証キットがそれぞれ1つずつ含まれています。

*1 DC-DON-SH01はSH004キットにのみ付属。Genome-CRISP™ AAVS1 ORF knock-in cloneは個別に検索しご注文頂くことができます。AAVS1ドナークローンのカスタム構築も承ります。

（A）

（B）

図.2　Genome-CRISP™ ヒトAAVS1セーフ・ハーバー遺伝子ノックインキットの模式図
（A）AAVS1 sgRNA/Cas9発現クローンおよびドナーDNAプラスミド
（B）AAVS1ノックイン検証用プライマー

20,000以上の配列検証済みヒトAAVS1セーフ・ハーバーノックインORFクローンをご用意しており、GeneCopoeia社のWEBサイトで検索して頂くことができます。本商品は、Genome-CRISP™ヒトAAVS1セーフ・ハーバー遺伝子ノックインキットを用いて、対象ORFをドナープラスミドからヒト第19染色体上のAAVS1セーフ・ハーバー部位へ特異的に組込むためのものです。

図.3　ヒトAAVS1セーフ・ハーバーノックインORFクローンマップ

ROSA26は、ROSAβgeo26座位としても知られる領域で、検証したほぼ全ての組織においてランダムに挿入した導入遺伝子から、βガラクトシダーゼを一様に高レベルで発現する、ROSAβgeo26と呼ばれる特定マウス系統の第6染色体上で最初に見つかりました。この座位からは１つのタンパク質コード転写物が発現し、挿入配列によって非コード転写物のみが破壊されます。挿入配列がホモ接合の子供はヘテロ接合の子供に比べてわずかに出生率が低いものの、ホモ接合体では正常に発生するようであり繁殖性です。そのため、「Rosa26」座位は適応度において明白な有害作用を生じず、定常遺伝子発現が可能な導入遺伝子挿入部位としてよく利用されています。ROSA26特異的なCRISPR-Cas9システムを用いることでマウスゲノムのROSA26座位に２本鎖切断（DSBs）を導入し、天然のDNA修復機能を刺激することができます。また、ROSA26 ORFノックインクローンを同時に用いることで、相同組換え（HR）が生じセーフ・ハーバー座位にORFノックインクローン由来のDNA断片をノックインすることができます。

本キットは、CRISPR-Cas9介在型相同組換えを利用して対象遺伝子、選択マーカー、または他の遺伝要素をマウスゲノム上のROSA26セーフ・ハーバー部位に特異的に導入できるようデザインされており、ROSA26 sgRNA/Cas9発現クローン、ドナークローニングベクターまたはドナークローン*2、ポジティブクローン、およびノックインPCR検証キットがそれぞれ１つずつ含まれています。

*2　Genome-CRISP™ マウスROSA26 ORFノックインクローンは個別に検索しご注文頂くことができます。ROSA26ドナークローンのカスタム構築も承ります。

（A）

（B）

図.4　Genome-CRISP™ マウスROSA26セーフ・ハーバー遺伝子ノックインキットの模式図
（A）ROSA26 CRISPR-Cas9とドナーDNAプラスミド
（B）ノックイン検証用プライマー

（A）

（B）

図.5　マウスゲノムセーフ・ハーバーROSA26遺伝子標的
ROSA26 RFPコントロールプラスミド DC-RFP-SH02 (800 ng)をROSA26 All-in-Oneタイプ sgRAクローン(600ng) とともに6ウェルプレートに播種したマウスNuero2a細胞にトランスフェクションした。コントロールとして、コン トロールプラスミドDC-RFP-SH02 (800 ng)のみを同様にトランスフェクションした。
（A）トランスフェクションの48時間後に細胞を1:10に分割して新しい6ウェルプレートに播種し、1.0 µg/mlのピューロマイシンを加えて選択を行った。画像は薬剤処理の2週間後に撮影した。ROSA26 RFPコントロールのみを導入した細胞のコロニーは、薬剤処理後ほとんど残らなかった。
（B）HR接合部分増幅用PCRプライマーを用いて特異的組換えが問題なく行われたか検証した。

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