新生RNAの解析に SLAMseq Metabolic RNA-Seq Kit

スタンダードな RNA-Seq の手法では total RNA 量の測定が可能ですが、RNAの動態（転写や分解）を解析することはできません。Lexogen 社の SLAMseq (thiol (SH)-Linked Alkylation for the Metabolic sequencing of RNA) Kitでは、煩雑な単離作業無しで、サンプル中に元々存在している RNA と新しく合成されたRNA を並行して解析可能です。

• トランスクリプトームワイドに RNA 合成とターンオーバーを解析
• 新生 RNA の発現量と転写産物の安定性を解析
• 遺伝子発現解析にお勧め
• プルダウン法のような単離作業は不要
• QuantSeq 3' mRNA-Seq Kit と併用可能

SLAMseq Kit はトランスクリプトームワイドで定量的な新規の解析法である thiol (SH)- Linked Alkylation for the Metabolic Sequencing of RNA を基にしています⁽¹⁾。細胞培養時に 4- チオウリジン（S4U）を添加し、新生 RNA に S4U を取り込ませます。その後、ヨードアセトアミド（IAA）により S4U をアルキル化し、ライブラリ作製後、シーケンス解析を行います。ライブラリ作製の逆転写の過程で、アルキル化された S4U にはアデニン（A）ではなくグアニン（G）が合成されるため、チミン（T）からシトシン（C）への変換を解析することで元々存在している RNA と新しく合成された RNA をバイオインフォマティクなレベルで識別可能です（図 1）。Lexogen 社 QuantSeq Kit と併せてご使用いただけます。

図1. SLAMseq のワークフロー
細胞培養時に 4-チオウリジン（S4U）を添加し、新生 RNA に取り込ませる（ウラシルの代わりに取り込まれる）。Total RNA を精製後、ヨードアセトアミド（IAA）を加え、S4U のチオール基をアルキル化する。Lexogen 社 QuantSeq 3' mRNA Seq library Prep kit でライブラリ作製する際の逆転写のステップで、カルボキシアミドメチル基（アルキル化された S4U）に対し、G（赤字）が合成される。元々存在した RNA は S4U を取り込んでおらず、逆転写の際、同部位には A（黒字）が合成されるため、T から C への変換を解析する事で元々存在した RNA と新生 RNA を区別する事ができる。

SLAMseq Kit は metabolic RNA-Seq 実験のための S4U 取り込み条件検討用の試薬や S4U ラベリング用の試薬が全て セットになっています（表 1）。SLAMSeq Explorer Kit では、標的細胞における S4U の毒性評価や、S4U 濃度の最適化が可能です。また、SLAMseq Kinetics Kit の Anabolic Kinetics Module では RNA 合成を、Catabolic Kinetics Module では RNA 代謝を評価することが可能です。

RNA 合成および分解速度

マウス ES 細胞（mESCs）について S4U で標識し、total RNA を抽出後、アルキル化を行って QuantSeq 3' mRNA library Prep Kit を用いてライブラリを調製し、シークエンス解析を行いました（SLAMseq Kinetics Kit Anabolic Module、 品 番：061.24）。次のセットアップとして、 mESCs を 24 時間 S4U metabolic RNA 標識し、洗浄後、非標識のウリジンを用いて停止させました（SLAMseq Kinetics Kit Catabolic Module、品番：062.24）。SLAMSeqデータは SLAMdunk パイプラインを用いて解析しました。 Whole Transcriptome に対する RNA のターンオーバー率を解析し、2 つの遺伝子について合成と分解速度の動態を図2 に示しました。

図2 RNA の合成と分解の経時変化
培地に終濃度 100 µM で S4U を添加し 24 時間培養後、RNA 合成量を測定した（S4U Pulse）。S4U を培地から取り除き、非標識のウリジンを添加後さらに24 時間培養し、RNA の分解速度を測定した（U Stop）。

Lexogen の SLAmseq Kinetics Kit の Anabolic とCatabolic モジュールでは、トランスクリプトームの動態解析が可能です。

新生 RNA および total RNA の遺伝子発現差異解析

SLAMSeq では、同一サンプル由来の total RNA と新生RNA の遺伝子発現解析が可能です。標準的、定常状態、 SLAMSeq ベースの metabolic RNA-Seq の違いを見るために、ヒト細胞株を用いて遺伝子発現差異解析を行いました 2。 SLAMSeq では、遺伝子発現差異を良く検出、定量しました（図3左）。SLAMSeq を用いて新生 mRNA 量を解析した結果、通常の RNA-Seq では解析できなかった阻害剤処理に対する転写応答が明らかになりました（図 3右）。転写の動態や細胞内の応答メカニズムを把握できるため、創薬研究におすすめです。

図3 遺伝子発現差異解析
コントロール（DMSO）および BCR/ABL 阻害剤（ニロチニブ）を処理した K562 細胞について解析を行った。新生 RNA 量は、T ＞ C を含むリード（緑色）で示しており、Total mRNA 量（灰色）と比較して高い log fold-change（LFC）を示した（左図）。新生 mRNA（緑色）では、より多くの発現変動遺伝子が検出された（右図）。（Figure modified from Muhar et al, 2018⁽²⁾）

SLAM-ITseq：組織・細胞種特異的な in vivo 遺伝子発現解析

特定の細胞にウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ（UPRT）を発現する遺伝子改変動物に 4- チオウラシルを投与すると、この特定の細胞では新生 RNA が標識されます。得られた RNA-Seq データセットで塩基の変換を調べることで、組織または細胞特異的な in vivo 遺伝子発現解析が可能です⁽³⁾。このアプローチでは、組織間の RNA の移動もモニタ ーできると考えられます⁽⁴⁾。

ウイルス核酸のキャリーオーバーと細胞感染の判別

SLAMseq によって、細胞内で複製しているウイルスや細菌の RNA とウイルス核酸のキャリーオーバーとを明確に判別することが可能です。従来の RNA-Seq によるコンタミネーションの検出は非常に高感度ですが、一方で擬陽性につながる場合もあります。S4U で標識した RNA の検出は転写活性のあるウイルスまたは細菌の明確なサインとなります ^{(5, 6)}。

Lexogen 社では、SLAMseq 3' mRNA-Seq ライブラリ作製キット（イルミナ社シーケンサー用）で作製したライブラリから得られたデータを解析するためのカスタムパイプライン SLAMdunk を提供しています。SLAMdunk ソフトウェアは Bluebee® ゲノミクスプラットフォーム上で利用可能で、SLAMseq 実験で得られたシーケンスデータを簡便に解析可能です（図4）。圧縮した fastq ファイルをアップロードし、適切な種を選択します。データを処理した後、SLAMdunkは T>C 変換率に関する統計と 3' UTR 領域に対するアラインメントをアウトプットします。結果は Bluebee® プラットフォームからダウンロード可能です。SLAMseq、QuantSeq、SLAMdunk を併せて利用することで、ハイスループットかつ時間分解の RNA-Seq 実験が可能となります。

図4. SLAMdunk データ解析パイプライン

【関連情報】

• LEXOGEN社：RNAシーケンス解析（NGS）用ライブラリ構築キットカタログ
• 特集：次世代シーケンシング　ライブラリ調製　ポータルサイト

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