FAQ: Atlas Antibodies(ATL)社の抗体技術および商品ついて

ATL社は、Triple A ポリクローナル と Precis A モノクローナル という 2 つのブランドの一次抗体のメーカーおよびサプライヤーです。Triple A ポリクローナルは、完全なヒト プロテオームのタンパク質発現マップを作成するためのHuman Protein Atlas プロジェクトの一環として最初に開発された、高度な研究グレードのウサギ ポリクローナルです。ATL社のカタログには、IHC、ICC、およびウエスタンブロットで検証済みの 21,000 を超える Triple A ポリクローナルを提供しています。 Precis A モノクローナルはマウスモノクローナル抗体です。Precis A モノクローナルの開発は、Human Protein Atlas の知見に基づいており、慎重な抗原設計と抗体性能の広範な検証が行われています。さらに、各 Precis A モノクローナル はエピトープ マッピングされており、特定のターゲットに最も関連する特性データが提供されています。

• 商品詳細：Atlas Antibodies社 ポリクローナル抗体／モノクローナル抗体
• 商品詳細：HPAプロジェクトの詳細はこちら

製品データ ページで利用可能な選択された IHC 染色に加えて、Human Protein Atlas (HPA) ポータルでヒト組織からのすべての IHC 画像にアクセスできます。この情報を見つけるには、関心のある抗体製品ページの「Additional Images」の下にあるリンクをたどってください。高解像度の IHC 画像は、さまざまな組織をクリックすると、Human Protein Atlas ポータルで見つけることができます。がん組織の IHC 画像は、Pathology Atlas にあります。

すべての IHC 画像は、熟練したスタッフによって手作業で注釈が付けられています。単独の染色パターンに基づいて、各抗体の偏りのないアノテーションを達成するために、文献を参照することなく最初のステップが実行されます。次に、別の研究者チームが、各抗体の IHC 染色結果を利用可能な文献と比較します。各抗体の染色結果は、27 の異なるヒト細胞株からの RNA 配列決定データ、および同じ標的に対する他の抗体を使用した結果と比較されます (利用可能な場合)。 追加の検証として、IHC では、直交法と独立した抗体による検証を使用して強化された検証が実行されます。検証の詳細についてはこちらを、さまざまな強化された検証方法についてはこちらをご覧ください。

• 商品詳細： Atlas Antibodies（ATL）社　抗体のバリデーション

ALT社の標準的な抗原回復方法は、pH 6の賦活化バッファー での熱誘導エピトープ回復 (HIER) です。詳細については、 IHC プロトコルを参照ください 。

IHCバリデーションでは、抗体はパラフィン包埋組織および細胞で評価されます。ただし、私たちの経験では、通常、新鮮な凍結組織でも良好に機能します。

IHCで当社の抗体を使用する場合、以下のプロトコールをお勧めします：

＜参考資料＞

• IHC Standard Protocol
• IHC Protocol - Ventana Discovery XT
• IHC Protocol - IF Detection
• IHC-IF Protocol - Multiplex

ALT社の抗体の多くはウエスタンブロットでご使用いただけます。抗体は、内因性ヒト細胞株、組織タンパク質溶解物、または組み換え完全長ヒトタンパク質溶解物で試験済です。当社の抗体がウェスタンブロットでどのように検証されているかについては、こちらをご覧ください。

実際のウエスタンブロット (WB) バンドサイズが予測サイズと異なる場合がある理由はいくつかあります。そのような理由には、次のようなものがあります。

• スプライス バリアント: 選択的スプライシングにより、1 つの遺伝子がさまざまなサイズのタンパク質を生成することがあります。
• グリコシル化やリン酸化などの翻訳後修飾により、標的タンパク質の分子量が増加します。
• プロタンパク質の活性型を生成するための翻訳後切断は、例えばプロインスリンおよびインスリンなどの分子量変化をもたらします。
• サンプルが還元条件下で実行されたとしても、二量体と多量体が存在する可能性があります。
• 膜貫通タンパク質などの疎水性タンパク質は、ゲルを通過するのが困難な場合があり、その結果、異なるマルチバンド パターンが生じます。

ウエスタンブロットに使用されるすべての細胞および組織溶解物は、Proteoextract Complete Mammalian Proteome Extraction Kit (Calbiochem) を使用して調製されます。

こちらにATL当社製品を用いたウエスタンブロットの標準プロトコールをご紹介します。 抗体に BSA ブロッキングが必要な場合は、代わりにBSA ブロッキング用ウエスタンブロット プロトコルを使用してください。 こちらですべてのプロトコルを見つけることができます。

ATL社の抗体の多くは、細胞株の免疫蛍光/免疫細胞化学 (ICC) に推奨されています。各抗体の製品ページには、抗体が検証されているすべてのアプリケーションと種に関する情報が含まれています。
また、ICC 検証済みのトリプル A ポリクローナルについては、Human Protein Atlas データベースのCell Atlas (ICC-IF 特性データ) へのリンクがあり、複数の細胞株から得られた追加画像が表示されています。Cell Atlasでは、緑色(抗体染色)、青色(核)、赤色(微小管)、黄色(小胞体、ER)のチャネルのオン/オフを切り替えることにより、選択された細胞株からのICC-IF画像を1つ以上の参照マーカーで可視化する方法を選択することができます。

ATL社の抗体で使用するために推奨する ICC-IF プロトコルは、こちらから入手できます。すべてのプロトコルはこちらでご覧いただけます。

ATL社の抗体は、ELISA セットアップで抗原 (組換えタンパク質) を認識するようにテストされています。ただし、ELISA は現在、検証済みのアプリケーションの 1 つではありません。

製品ページには、各抗体が現在検証されているアプリケーションと種が示されています。興味のある種またはアプリケーションがリストにない場合は、お問い合わせください。

Human Protein Atlas は、抗体を使用して完全なヒト プロテオームの特性を明らかにすることを目的としたスウェーデンの学術プロジェクトです。Human Protein Atlas のデータベースは、ヒトタンパク質発現のマップを提供し、研究者にとって貴重なツールです。 プロジェクト内で開発された抗体は、ATL社がTriple A ポリクローナルという商品名で製造・販売しています。

• 商品詳細：Atlas Antibodies社 ポリクローナル抗体／モノクローナル抗体
• 商品詳細：HPAプロジェクトの詳細はこちら

Triple A ポリクローナルおよびPrecisA モノクローナルは、他のヒトタンパク質との同一性が最も低い 50 〜 150 アミノ酸の Protein Epitope Signature Tag (PrEST) 配列を選択する独自の抗原設計ソフトウェアを使用して慎重に設計されています。PrESTのコンセプトは、抗体産生に使用する際に最高レベルの特異性を確保します。 Triple A ポリクローナルはウサギ由来で、PrecisA モノクローナルはマウス由来です。

抗体は、ヒトタンパク質フラグメントに対して開発され、ヒト組織および細胞に対して検証されています。抗体の選択は、げっ歯類のサンプルでも検証されます。これらの抗体は、プロテインアレイ (または ELISA) での特定のターゲット認識、および IHC、WB、および ICC-IF を用いたテストを含む、一連のバリデーションステップをパスします。得られた結果を文献、RNA配列決定情報、及び入手可能な場合は同じターゲットに対する他の抗体による結果と比較します。さまざまなアプリケーションでの検証プロセスの説明は、抗体検証ページでご覧いただけます。標準的なバリデーションに加えて、遺伝的バリデーション、直交バリデーション、独立した抗体によるバリデーション、組換え発現バリデーション及び移行捕捉MSバリデーションの5つのバリデーション法を用いて強化されたバリデーションが実施されます。

• 商品詳細：Atlas Antibodies社　抗体のバリデーション

ALT社の抗体は、IHC、WB、ICC などの 1 つまたは複数のアプリケーションで検証されています。抗体に対する検証済みアプリケーションに関するすべての情報は、抗体製品ページでご覧いただけます。

ATL社の抗体の多くは、対応するマウスおよびラットのタンパク質も認識します。この情報は、各抗体の製品ページで報告されています。さらに、マウスおよびラットのオルソログに対する抗原配列の同一性に関する情報は、すべての抗体の製品データシートで報告されています。

すべての推奨プロトコルは、こちらで確認できます。 関心のある抗体の製品ページにアクセスして、各アプリケーションに推奨される希釈率をご確認ください。

Triple A ポリクローナルは、一貫性を確保するために標準化された製造プロセスを使用して製造されます。組換え PrEST 抗原をアフィニティー リガンドとして使用する独自の 3 段階の抗体精製プロセスによって、標的特異的な抗体のみが回収されます。 PrecisA モノクローナルは、プロテイン A 精製品です。

いいえ、現在、ATL社の抗体はすべて非標識です。

同じ製品名の PrecisA モノクローナル が複数ある場合は、抗体のアイソタイプが異なるか、異なるエピトープを認識することを意味します。これらの抗体が同じまたは類似の染色パターンを示す場合、抗体の信頼性を高めます。これは、標的タンパク質の組織および細胞内の位置を説明する文献が非常に限られている、これまでに特性が明らかになっていないタンパク質にとって特に重要です。製品データシートを参照していただき、ニーズに最適な製品を選択してください。サポートが必要な場合は、お気軽にお問合せください。

同じ製品名の 2 つの異なる Triple A ポリクローナルがある場合、それは抗体が同じタンパク質の異なる領域に対して向けられていることを意味します。これらの抗体が同じまたは類似の染色パターンを示す場合、これは抗体自体の信頼性を高めます。そして、標的タンパク質の組織および細胞内の位置を説明する文献が非常に限られている、以前に特徴付けられていないタンパク質にとって特に重要です。 製品データシートを参照して、ニーズに最適な製品を選択してください。サポートが必要な場合は、お気軽にお問合せください。

ATL社の抗体設計は、ENSEMBL データベースに記載されている情報に基づいています。各抗体の製品ページには、Human Protein Atlas ポータルの対応する抗体ページへのリンクがあります。そこでは、タンパク質をコードする ENSEMBL 遺伝子転写産物と一致する抗原配列の同一性を見つけることができます。さらに、ページの下部には、Antigen View という機能があります。このグラフィカル ビューにより、一致する転写産物またはアイソフォームと比較して、標的タンパク質上の抗原配列の位置を調べることができます。抗原配列は、水平の緑色のバーとして視覚化されます。もちろん、 サポートが必要な場合は、お気軽にお問合せください。

ALT社の製品のリファレンスは、各製品の製品ページで定期的に更新されます。 現在、影響力の大きいジャーナルにおいて、ATL社製品が使用された文献数が増えていることを誇りに思っています。お客様が投稿された文献において、ATL社の製品 (抗体、PrEst 抗原、または QPrEST) を使用したことがある場合は、 support@atlasantibodies.com までご連絡ください。

PrEst抗原は、Triple Aポリクローナル抗体及びPrecis Aモノクローナル抗体の産生に使用される免疫原です。PrEst抗原は、対応する抗体とともに、コントロール抗原(例えばブロッキング剤及びポジティブコントロール)として有用です。それらは、His6 とアルブミン結合タンパク質 (ABP) からなる二重タグを備えた融合タンパク質として発現される約 50 〜 150 アミノ酸の組換えヒトタンパク質エピトープ シグネチャー タグ (PrEST) です。タンパク質特異的な PrEST配列は、すべての抗体の製品ページで指定されています。

• 商品詳細：PrEST抗原

PrEST 抗原は、他のヒトタンパク質との配列同一性ができるだけ低くなるように設計されています。PrEST の選択は、スライディング ウィンドウ アルゴリズム(a sliding window algorithm)に基づいており、特定のヒトタンパク質のさまざまな部分と、ヒト プロテオームの他のすべてのタンパク質配列との局所的および領域的な配列同一性を予測します。シグナルペプチドと膜領域は、Phobius、SPOCTOPUS、SignalP などの複数のソフトウェアを使用して回避されます。

二重タグは、免疫増強アルブミン結合タンパク質 (ABP) タグを含むフレーム内のヘキサヒスチジル (His6) タグで構成されています。His6 タグは IMAC 精製に使用でき、連鎖球菌プロテイン G のアルブミン結合領域に由来する ABP に融合したタンパク質は、ヒト血清アルブミン (HSA) アフィニティークロマトグラフィーで精製できます。

デュアル タグのシーケンスは次のとおりです。
GSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASLAEAKVLANRELDKYGVSDYHKNLINNAKTVEGVKDLQAQVVESAKKARISEATDGLSDFLKSQTPAEDTVKSIELAEAKVLANRELDKYGVSDYYKNLINNAKTVEGVKALIDEILAALPGTFAHYMDPNSSSVDKLAAA

特定のヒトタンパク質配列は、「VDKLAAA」の直後から始まります。

PrEst抗原は、ニッケル含有マトリックス (IMAC)を使用して精製されており、純度は SDS-PAGEを使用して分析されています。

PrEST のクローニングには、RT-PCR 法でいくつかのヒト組織からの材料からなる RNA のプールが使用されます。増幅された遺伝子断片は、ビオチン化プライマーと磁気ビーズを用いた固相クローニングを使用して発現ベクター pAff8c にクローニングされ、すべてのクローンは配列検証済みです。大腸菌（ロゼッタ）組換えタンパク質発現系が、クローンを発現するために使用されます。

一部の PrEST抗原は、可溶性にするために 1 M 尿素を必要とします。より低い尿素濃度を使用したい場合は、少量のサンプルで試してみることをお勧めします。