Q&A : SEW社 遠心分離媒体について

通常の場合、影響しません。健常人からの血液サンプルに対してLymphoprepを推奨プロトコールに従っている限り、EDTA、クエ ン酸、またはヘパリンを抗凝固剤として使用して、単核球（リンパ球、単球）の分離が可能です。 EDTAを用いたときが最も一貫した結果が得られているようです。

必須ではありません。しかし、単核球の収量（約85-90%）は希釈した血液を用いたときの収量（約95-98%）より低くなり、Lymphoprepの上層にのせる操作もむずかしくなります。

はい、Lymphoprepは白血球を多く含む血漿から単核細胞画分と顆粒球画分を調製するのにも使用できます（この場合はサンプルを希釈する必要はありません）。

いくつかの理由が考えられます。

１）遠心チューブ内の液量のトータルボリュームが推奨する量より多い場合。15mLチューブの推奨量は3mLのLymphoprepと6mLの希釈血液サンプルです。6mL以上のサンプルで使用すると、遠心開始時に十分な重力がかからず、正しく分離できない可能性があります。推奨量で使用するか、ご自身で遠心時間をご検討ください。

２）血液が患者さんからの臨床サンプルの場合。血液内の細胞の密度が予測できない変化をしているかもしれません。

３）血液が採血から12時間以上経っている場合。時間が経つと徐々に分離が悪くなりますので、採血後2時間以内の血液を使用することをおすすめしています。12時間以上経ったものを使用しないでください。

注）OptiPrep Application Sheet C04に記載の方法を用いると古い血液サンプルから分離ができるかもしれません。

• OptiPrep Application Sheet C04

通常ローター減速時にブレーキの効きが最大になるためです。これが溶液中に渦を起こし、混合がおこります。極端な場合、ペレットがその上層の溶液中に分散するかもしれません。もう一つ考えられる理由として、血液の層化が悪いと界面での混合をもたらすかもしれません。

はい。分離能は温度とあまり関係してません。遠心時間を5分程度延長する必要があるかもしれません。また4℃などの低温条件では粘度が高くなり分離しにくい場合があります。

霊長類と数種類の反すう動物（ウシ、ウマ、ヤギ、羊など）、また、ネコやイヌの血液にLymphoprepを使用した文献例がありますが、詳細なプロトコールやデータはなく、残念ながら、推奨プロトコールのご用意はありません。
げっ歯類とウサギの血液については、特有の密度バリアが形成されるため、OptiPrepでの推奨プロトコールのご参照をお勧めいたします。(OptiPrep Application Sheet C43)。
OptiPrep Application Sheet C6、C7、C8の浮遊法も併せてご参照ください。

• OptiPrep Application Sheet C43
• OptiPrep Application Sheet C06
• OptiPrep Application Sheet C07
• OptiPrep Application Sheet C08

血小板を除去するには、データシートのプロトコールにある通り、250xg 10分間遠心して細胞を沈殿させています。血小板の多くは上清に残り、その上清を除きペレットを食塩水でwashします。ただし、これはあまり効率が良くないので、より効率的に血小板を除去する方法としてOptiPrepのApplication Sheet C12に記載の方法を推奨いたします。他の方法としては、浮遊法を用いるもので、OptiPrepのApplication Sheet C5をご参照ください。

• OptiPrepのApplication Sheet C12
• OptiPrepのApplication Sheet C05

以下の原因が考えられます。分離時の条件を再度ご確認ください。

• 遠心力の計算が適切でない
  データシート記載の遠心力(xg)は、遠心機のローターの最大半径（Rmax）では無く平均半径（Rav）をもとに計算されています。最大半径（Rmax）で遠心力を計算した場合、推奨の遠心条件と比べて、実際の遠心力が不足する場合があります。ご使用の遠心機の遠心力の計算方法をご確認ください。
• サンプルが正常ヒト血液でない場合
  Lymphoprepは、正常ヒト新鮮血液からの分離目的で開発されております。データシートに記載の分離条件も、同じく健常ヒト新鮮血液サンプルでの試験を元に設定されております。サンプルが患者（病態)血液、または採血後時間が経過した血液の場合は分離が難しい場合がございます。
• 加速、ブレーキ等の設定が最適でない場合
  遠心時の層の形成に影響を及ぼすため、急激な加速、停止は厳禁です。アクセラレーション、ブレーキ等の設定をご確認頂き、特にブレーキはOFF設定での遠心をしてください。
• 重層時のハンドリングが最適でない場合
  遠心前の重層時に急いで作業を行われている場合などは、分離後の層の形成に影響を及ぼす可能性がございます。Lymphhoprep と血液の重層時、できる限り慎重にゆっくりと溶液を重層してください。
• Lymphhoprepおよびサンプル量、チューブサイズが最適でない場合
  Lymphhoprepおよびサンプル量、使用チューブのサイズの条件を変更されている場合は、データシート記載の遠心条件を適用できない場合があります。変更された箇所が無いかをご確認ください。

赤血球のコンタミは希釈血液の量が推奨量よりも多いとおこります。Lymphoprep Tube 使用の際は推奨プロトコールを準拠するようお願いいたします。

推奨方法のステップに厳密に従ってご使用ください。

重要なポイントは、
１）採血後すぐの血液サンプルを使用してください。
２）健康なヒトの血液（できれば 男性）を使用してください。
３）抗凝固剤としてEDTAを使用してください。
４）血液とPolymorphprepの比率を変えないでください。15mL のチューブのときは（未希釈の）血液5mLとPolymorphprep5mL、50mLチューブのときは各15mL。
５）rpmの設定はr(max)で はなく、r(av)で500gになるように設定してください。
６）遠心の温度と回転数を推奨通りにしてください。

PolymorphprepのApplication Sheetをご参照ください。

• PolymorphprepのApplication Sheet

上記の手順に従って使用されたかご確認ください。

あいにくお使いいただけません。白血球を多く含む血漿からの顆粒球の分離はOptiPrep Application Sheet C11に記載の方法をご参照ください。

• OptiPrep Application Sheet C11

推奨していません。しかしながら、ヒト以外の血液サンプルに使用した論文がございます。OptiPrep Application Sheet C45をご参照ください。

• OptiPrep Application Sheet C45

OptiPrep Application Sheet C09に記載の方法がひとつの推奨方法です。これは白血球を多く含む血漿をサンプルとして室温で分離する方法です。また、OptiPrep Application Sheet C10に記載の方法もおすすめで、全血をサンプルとして4℃で分離する方法です。

• Application Sheet C09
• Application Sheet C10

最も確実な方法というのは残念ながらありません。OptiPrep Application Sheet C10に記載の通り、上層の密度調整についての情報しかありません。

• OptiPrep Application Sheet C10

OptiPrep Application Sheet C12に記載の分離は、白血球と赤血球の沈殿速度に比べて血小板の沈殿速度が遅いことに基づいています。相対的なサンプル量や密度の層が推奨のもではない場合と、減速にブレーキを使用した場合に起こります。

• OptiPrep Application Sheet C12