Q&A : SEW社 遠心分離媒体について

いいえ、特別なチューブは必要ありません。お使いの遠心機に適したチューブをご使用ください。

必須ではありません。ただし、単核球の収量（約85〜90％）は、希釈した血液を用いた場合（約95〜98％）より低くなります。また、Lymphoprep™ の上層に血液を重層する操作も難しくなります。

Lymphoprep™ は室温に戻してからの使用を推奨します。Lymphoprep™ とサンプルの間に温度差があると、最悪の場合、分離がうまく行われない可能性があります。未開封・開封後ともに、遮光条件下であれば室温で安定な溶液ですので、室温での保存が便利です。 ただし、開封後室温で保存する場合はコンタミネーションにご注意ください。

通常は影響しません。健常人由来の血液サンプルで、Lymphoprep™ を推奨プロトコールに従って使用している限り、EDTA、クエン酸、またはヘパリンを抗凝固剤として用いて単核球（リンパ球、単球）を分離できます。なお、EDTAを用いた場合が最も一貫した結果が得られています

適切に遠心でき、分画を回収できるのであれば、少量のサンプルでも使用可能です。効率的な分離のためには、希釈血液とLymphoprep™ を2:1の割合にすることが重要です。 例えば、血液100 ?Lを使用する場合は、NaCl溶液100 ?Lで希釈し、その上にLymphoprep™ 100 ?Lを慎重に重層してください。

霊長類や数種類の反すう動物（ウシ、ウマ、ヤギ、羊など）の血液にLymphoprep™ を使用した例はありますが、残念ながら、詳細なプロトコールやデータはありません。詳細は以下のApplication sheet をご参照ください。

• Optiprep™ Application Sheet C45
• Optiprep™ Application Sheet C09

使用できません。白血球を多く含む血漿からのPBMCsの分離にはOptiPrep™ をご使用ください。

• Optiprep™ Application Sheet C11

いくつかの理由が考えられます。

1. 遠心チューブ内の液量が多すぎる場合
   例えば15mLチューブの推奨量は、3mLのLymphoprep™ と6mLの希釈血液サンプルです。6mL以上のサンプルで使用すると、遠心開始時に十分な重力がかからず、明瞭に分離できない可能性があります。推奨量で使用するか、必要に応じて遠心時間を調整してください。
2. 疾患を有する患者由来サンプルを使用している場合
   血液内の細胞の密度が予測できない変化をしている場合があります。
3. 採血から時間が経過している場合
   時間が経つにつれて分離が悪くなります。採血後2時間以内の血液を使用してください。12時間以上経ったものを使用しないでください。

注：古い血液サンプルの場合でも、OptiPrep™ Application Sheet C04に記載の方法で分離できる可能性があります。

• OptiPrep™ Application Sheet C04

主な原因は、遠心ローターの減速時にブレーキが強くかかることです。これにより溶液中に渦が発生し、層が混ざってしまいます。極端な場合は、ペレットが上層の溶液中に分散してしまうこともあります。

もう一つの可能性として、遠心前に血液とLymphoprep™ の間に明確な層が形成されていないと、境界面が不安定になることがあります。

血小板を除去するにはプロトコールに従い、250×gで10分間遠心して細胞を沈殿させます。血小板の多くは上清に残るため、その上清を除去し、ペレットを食塩水で洗浄します。ただし、この方法はあまり効率が良くありません。 より効率的に血小板を除去する方法としては、OptiPrep™ Application Sheet C12に記載の方法を推奨します。また、別の方法として浮遊法を用いるものがあり、OptiPrep™ Application Sheet C05をご参照ください。

• OptiPrep™ Application Sheet C12
• OptiPrep™ Application Sheet C05

以下の原因が考えられます。分離時の条件を再度ご確認ください。

1. 遠心力の計算が適切でない
   データシート記載の遠心力(xg)は、遠心機のローターの最大半径（Rmax）では無く平均半径（Rav）をもとに計算されています。最大半径（Rmax）で遠心力を計算した場合、推奨の遠心条件と比べて、実際の遠心力が不足する場合があります。ご使用の遠心機の遠心力の計算方法をご確認ください。
2. サンプルが正常ヒト血液でない場合
   Lymphoprep™ は、正常ヒト新鮮血液からの分離目的で開発されております。データシートに記載の分離条件も、同じく健常ヒト新鮮血液サンプルでの試験を元に設定されております。サンプルが患者（病態)血液、または採血後時間が経過した血液の場合は分離が難しい場合があります。
3. 加速、ブレーキ等の設定が最適でない場合
   遠心時の層の形成に影響を及ぼすため、急激な加速、停止は厳禁です。アクセラレーション、ブレーキ等の設定をご確認頂き、特にブレーキはOFF設定での遠心をしてください。
4. 重層時のハンドリングが最適でない場合
   遠心前の重層時に急いで作業を行われている場合などは、分離後の層の形成に影響を及ぼす可能性がございます。Lymphhoprep™ と血液の重層時、できる限り慎重にゆっくりと溶液を重層してください
5. Lymphhoprep™ およびサンプル量、チューブサイズが最適でない場合
   Lymphhoprep™ およびサンプル量、使用チューブのサイズの条件を変更されている場合は、データシート記載の遠心条件を適用できない場合があります。変更された箇所が無いかをご確認ください。

推奨方法のステップに従ってご使用ください。重要なポイントは、以下の通りです。

1. 1）採血後すぐの血液サンプルを使用してください。
2. 2）健康なヒトの血液を使用してください。
3. 3）抗凝固剤としてEDTAを使用してください。
4. 4）血液とPolymorphprep™ の比率を変えないでください。15mL チューブを用いる際は（未希釈の）血液とPolymorphprep™ を各5mL、50mLチューブを用いる際は各15mLにしてください。
5. 5）rpmの設定はr(max)で はなく、r(av)で500gになるように設定してください。
6. 6）遠心の温度と回転数を推奨値に設定してください。

上記の手順に従って使用されたかご確認ください。

使用できません。白血球を多く含む血漿からの顆粒球の分離にはOptiPrep™ をご使用ください。

• OptiPrep™ Application Sheet C11

推奨していません。

血小板のほとんどはPBMCsを含む上層に存在します。血小板の密度は1.04〜1.08 g/mLであり、Polymorphprep™ の密度は1.113 g/mLなので、血小板はPolymorphprep™ の上方に位置します。

Polymorphprep™ とOptiPrep™ の主な違いは、適用可能なサンプルです。全血からPBMCsと顆粒球を同時に分離する場合は、Polymorphprep™ を推奨します。
血液以外の組織から顆粒球やその他の細胞を分離する場合には、OptiPrep™ の使用を推奨します。

OptiPrep™ Application Sheet C10をご参照ください。

• Optiprep™ Application Sheet C10

残念ながら、最も確実な方法というのはありません。