Applied Biological Materials社のゲノム編集ツールを用いた実験検証CRISPR-Cas9レンチウイルスシステムを用いたヒト胚性腎臓細胞におけるGFPレポーターノックアウト

CRISPR-Cas9システムは、高い特異性とフレキシブルなゲノム編集を可能とする最先端のRNA誘導型のエンドヌクレアーゼ技術です。Applied Biological Materials(APB)社では、特異性が高く、オフターゲット効果を最小限に抑えた効率のよい標的ゲノム編集ツールおよびサービスを提供しています。とくに、二本鎖切断（DSB）を導入するための標的配列特異的ガイドRNAコンストラクトは、ヒト、マウス、ラットの遺伝子を網羅しており、各々レンチウイルスベクター、レンチウイルス粒子、アデノウイルス粒子の3種のフォーマットで販売しています。
ここでは、Applied Biological Materials(APB)社のCRISPR-Cas9システムのうち、レンチウイルス粒子フォーマットを用いてヒト胚性腎臓細胞におけるGFPレポーターのノックアウト効率を検証しました。

Cosmo Bio would like to acknowledge and thank the Applied Biological Materials Inc. for providing the data that CRISPR efficiency to use the lenti-virus presented here.

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細胞：　GFP安定発現HEK293細胞(品番：M019)

レンチウイルス（sgRNA）：　レンチU6-sgGFP（タイター：4x10⁷/mL）

GFP標的配列：　GCACGGGCAGCTTGCCGG

レンチウイルス（Cas9）：　Lenti SFFV-Cas9-E2A-Puro (1x10⁷/mL)(品番：K003)

HEK293-GFP用培養培地：　10% FBSと1% ペニシリン/ストレプトマイシン(品番：G255)添加 Prigrow III

ヒト胚性腎臓GFP陽性細胞を10% FBSと1% Pen/Strep添加 Prigrow III を用いて培養した。細胞を12ウェルプレートの各ウェルに100,000ずつ播種し、ウイルスをMOI=10で適用した。sgRNAウイルスのみ、またはCas9ウイルスのみを感染させた細胞をコントロールとした。両方のウイルスを感染させた細胞ではGFPノックアウトが見られることが期待される。細胞は5% CO₂インキュベーター内で、37℃で一晩培養した。ウイルスは翌朝に洗浄除去し、細胞に新鮮培地を添加後、さらに2〜3日培養した。

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3〜4日後、大幅なGFP発現の減少が見られた。トランスダクションから6〜7日後、90%以上の細胞においてGFP発現が完全に消失した。以上はFACSおよび蛍光顕微鏡により観察できた。

図.1 　GFP発現量変化のFACS分析
GFPを安定発現する293T細胞にLenti EF1-Cas9およびLenti U6-sgGFPをMOI = 10でトランスダクションした。トランスダクションから７日後にFACS分析を行った。CRISPR-Cas9システムを利用することでGFPレポーター遺伝子を良好にノックアウトすることができた。

図.2　 GFP発現量変化の蛍光顕微鏡観察
GFPを発現しているHEK293T細胞にLenti U6-sgRNAとLenti EF1-Cas9をMOI =10の条件でトランスダクションした。GFPシグナルの低下を定期的に確認することができた。