CytoSelect™ 24ウェル細胞浸潤 アッセイキット

 商品情報 CytoSelect™ 細胞浸潤アッセイ
（品番CBA-110、CBA-110COL、CBA-110LN、CBA-111、CBA-111COL、CBA-111LN）

1. 浸潤細胞株
2. 細胞培養培地
3. 無血清培地（例えば、0.5% BSA・2 mM CaCl₂・2 mM MgCl₂ を含む DMEM）
4. 細胞培養インキュベーター（37℃、5% CO₂）
5. 光学顕微鏡
6. 96ウェルマイクロタイタープレート（品番：CBA-110、CBA-110COL、CBA-110LNの場合）、蛍光プレートリーダーに適した 96ウェルプレート（品番：CBA-111、CBA-111COL、CBA-111LNの場合）
7. マイクロタイタープレートリーダー（品番：CBA-110、CBA-110COL、CBA-110LNの場合）、蛍光プレートリーダー（品番：CBA-111、CBA-111COL、CBA-111LNの場合）

2-1. 品番：CBA-110、CBA-110COL、CBA-110LN、CBA-111、CBA-111COL、CBA-111LN共通

1. 滅菌条件下で、浸潤チャンバープレートを10分間室温に置き、室温に戻しておきます。
2. 温めた無血清培地300μLをプレート内部に加え、インサートのマトリックス層を再水和させます。室温に1時間（品番：CBA-110、CBA-111の場合）、30分（品番：CBA-110COL、CBA-110LN、CBA-111COL、CBA-111LN の場合）置きます。
3. 無血清培地に0.5〜1.0×10⁶ cells/mLを入れ、細胞懸濁液を準備します。細胞浸潤阻害もしくは刺激薬剤を細胞懸濁液に直接加えておきます。
（NOTE：アッセイを行う前24時間飢餓状態にしておいた方がよいでしょう。）

2-2-1. 品番：CBA-110

4. マトリックス層を乱さないように注意しながらインサートから再水和培地（ステップ2）を除去します。
（NOTE：少量の再水和培地が残っていてもアッセイの性能に影響を与えません。）
5. 浸潤プレートの下層ウェルに評価する化学誘引物質もしくは10%FBSを含む培地を500μL加えます。
6. インサートに細胞懸濁液を300μL加えます。
7. 24-48時間インキュベーション（37℃、5%CO₂）します。
8. 注意してインサートから培地を吸引除去します。綿棒を使ってインサートの内側から非浸潤細胞をやさしく除去します。その際、ポリカーボネート膜に穴をあけないように注意し、内側周辺の細胞を除去して下さい。
9. 何も入っていないウェルに、400μLの細胞剥離溶液を入れ、そこにインサートを移し、室温に10分間置きます。
10. ビーカーにはった水で、何度か丁寧にインサートを洗浄します。インサートを空気乾燥させます。
11. （オプション）高倍率にした工学顕微鏡で少なくとも任意の3箇所のフィールドについて浸潤細胞を数えます。
12. 各インサートを空のウェルに移し、1ウェルあたり200μLの抽出溶液を加え、オービタルシェーカーで10分間インキュベーションします。
13. 96ウェルマイクロタイタープレートに各サンプル100μLを移し、プレートリーダー（OD560nm）で測定します。

2-2-2. 品番：CBA-110COL、CBA-110LN共通

4. マトリックス層を乱さないように注意しながらインサートから再水和培地（ステップ2）を250μL除去します。（再水和培地は50μL残ります。）
5. 250μLの細胞懸濁液をそれぞれのインサートに加えます。
6. 浸潤プレートの下層ウェルに評価する化学誘引物質もしくは10%FBSを含む培地を250μL加えます。
7. 12-24時間インキュベーション（37℃、5%CO₂）します。
8. 注意してインサートから培地を吸引除去します。綿棒を使ってインサートの内側から非浸潤細胞をやさしく除去します。その際、ポリカーボネート膜に穴をあけないように注意し、内側周辺の細胞を除去して下さい。
9. 24ウェル進運プレートの何も入っていないウェルに、400μLの細胞剥離溶液を入れ、そこにインサートを移し、室温に10分間置きます。
10. ビーカーにはった水で、何度か丁寧にインサートを洗浄します。インサートを空気乾燥させます。
11. （オプション）高倍率にした工学顕微鏡で少なくとも任意の3箇所のフィールドについて浸潤細胞を数えます。
12.各インサートを空のウェルに移し、1ウェルあたり200μLの抽出溶液を加え、オービタルシェーカーで10分間インキ ュベーションします。
13. 96ウェルマイクロタイタープレートに各サンプル100μLを移し、プレートリーダー（OD560nm）で測定します。

2-2-3. 品番：CBA-111

4. マトリックス層を乱さないように注意しながらインサートから再水和培地（ステップ2）を除去します。
（NOTE：少量の再水和培地が残っていてもアッセイの性能に影響を与えません。）
5. 浸潤プレートの下層ウェルに評価する化学誘引物質もしくは10%FBSを含む培地を500μL加えます。
6. インサートに細胞懸濁液を3004加えます。
7. 24-48時間インキュベーション（37℃、5%CO₂）します。
8. 注意してインサートから培地を吸引除去します。24ウェル浸潤プレートの何も入っていないウェルに225μLの細胞剥離液を入れ、そこにインサートを移し、37℃で30分間インキュベーションします。
9. インサートを何回か緩やかに傾け、細胞を膜の底面から完全に除去します。インサートを除き、廃棄します。
10. CyQuant® GRを4×溶出バッファーで1:75に希釈し（例えばCyQuant® GR dye 5μLに4×溶出バッファー370μLを加える）、十分量の4×溶解バッファー/CyQuant® GR染色溶液を準備します。
11. 各ウェル（予め225μLの細胞剥離液が含まれている）に4×溶解バッファー/CyQuant® GR染色溶液75μLを加えます。20分間室温に置きます。
12. 蛍光測定に適した96ウェルプレートに混合液200μLを移します。蛍光プレートリーダー（480nm/520nm）で測定します。

2-2-4. 品番：CBA-111COL、CBA-111LN共通

4. マトリックス層を乱さないように注意しながらインサートから再水和培地（ステップ2）を250μL除去します。（再水和培地は50μL残ります。）
5. 250μLの細胞懸濁液をそれぞれのインサートに加えます。
6. 浸潤プレートの下層ウェルに評価する化学誘引物質もしくは10%FBSを含む培地を250μL加えます。
7. 12-24時間、細胞培養インキュベーターでインキュベーションします。
8. 注意してインサートから培地を吸引除去します。24ウェル浸潤プレートの何も入っていないウェルに225μLの細胞剥離液を入れ、そこにインサートを移し、37℃で30分間インキュベーションします。
9. インサートを何回か緩やかに傾け、細胞を膜の底面から完全に除去します。インサートを除き、廃棄します。
10. CyQuant® GRを4×溶出バッファーで1:75に希釈し（例えばCyQuant® GR dye 5μLに4×溶出バッファー370μLを加える）、十分量の4×溶解バッファー/CyQuant® GR染色溶液を準備します。
11. 各ウェル（予め2254の細胞剥離液が含まれている）に4×溶解バッファー/CyQuant® GR染色溶液75μLを加えます。20分間室温に置きます。
12. 蛍光測定に適した96ウェルプレートに混合液200μLを移します。蛍光プレートリーダー（480nm/520nm）で測定します。