Chemotaxis CytoSelect™ 24ウェル 細胞遊走アッセイキット（蛍光）

 商品情報 CytoSelect™ 細胞遊走アッセイ
（品番CBA-103、CBA-102、CBA-101））

1. 遊走細胞株
2. 細胞培養培地
3. 無血清培地（例えば、0.5% BSA・2 mM CaCl₂・2 mM MgCl₂を含むDMEM）
4. 細胞培養インキュベーター（37℃、5% CO₂）
5. 光学顕微鏡
6. 蛍光プレートリーダーに適した96ウェルプレート
7. 蛍光プレートリーダー

2-1. 品番：CBA-101、CBA-102、CBA-103共通

1. 滅菌条件下で、24ウェル遊走プレートを10分間室温に置き、室温に戻しておきます。
2. 無血清培地に0.5〜5.0×10⁶ cells/mLを入れ、細胞懸濁液を準備しておきます。細胞遊走阻害もしくは刺激薬剤を細胞懸濁液に直接加えます。
（NOTE： アッセイを行う前24時間飢餓状態にしておいた方がよいでしょう。）
3. 遊走プレートの下層ウェルに評価する化学誘因物質もしくは10% FBSを含む培地を500μL（品番：CBA-101、CBA-103）、もしくは1.0mL（品番：CBA-102）を加えます。
4. 各インサートの内側に細胞懸濁液を200μL（品番：CBA-102、CBA-103）、もしくは300μL（品番：CBA-101）を加えます。

2-2-1. 品番：CBA-102、CBA-103共通

5. プレートをカバーし、1〜24時間インキュベーションします。
6. 24ウェル遊走プレートの何も入っていないウェルに細胞剥離溶液を200μL（品番：CBA-103の場合）もしくは500μL（品番：CBA-102の場合）入れておきます。
7. 注意してインサートの内側の培地を吸引除去します。そしてそのインサートをステップ6で用意した細胞剥離溶液が入ったウェルに移します（NOTE：膜を通過した化学誘因物質や遊走した細胞が入ったウェルの培地はそのままとっておきます）。
8. インサートを何回か緩やかに傾け、細胞を膜の底面から完全に剥離させます。
9. ステップ7の細胞剥離溶液200μL（品番：CBA-103の場合）もしくは500μL（品番：CBA-102の場合）が入ったウェルに、遊走細胞を含む培地溶液500μLのうち400μL（品番：CBA-103)、もしくは1.0mLのうち800μL（品番：CBA-102の場合）を移します。よく混ぜ、96ウェルプレートにその混合液1804を移します。
10. CyQuant® GRを4X 溶解バッファーで1：75に希釈し（例えばCyQuant® GR dye 5μLに4X溶解バッファー370μLを加える）、十分量の4X溶解バッファー/CyQuant® GR dye溶液を準備します。
11. 遊走細胞が入っている96ウェルプレートの各ウェルに4X溶解バッファー/CyQuant® GR dye溶液60μLを加え、室温に20分間おきます。
12. 蛍光測定に適した96ウェルプレートに混合液200μLを移します。蛍光プレートリーダー（480nm/520nm）で測定します。

2-2-2. 品番：CBA-101

5. プレートをカバーし、2〜24時間インキュベーションします。
6. 24ウェル遊走プレートの何も入っていないウェルに細胞剥離溶液を225μL入れておきます。
7. 注意してインサートの内側の培地を吸引除去します。そしてそのインサートをステップ6で用意した細胞剥離溶液が入ったウェルに移し、37℃、30分間インキュベーションします。
8. インサートを何回か緩やかに傾け、細胞を膜の底面から完全に剥離させます。
9. CyQuant® GRを4X溶解バッファーで1：75に希釈し（例えばCyQuant® GR dye 5μLに4X溶解バッファー370μLを加える）、十分量の4X溶解バッファー/CyQuant® GR dye溶液を準備します。
10 . 遊走細胞が入っている24ウェル遊走プレートの各ウェルに4X溶解バッファー/CyQuant® GR dye溶液75μLを加え、室温に20分間おきます。
11 . 蛍光測定に適した96ウェルプレートに混合液200μLを移します。蛍光プレートリーダー（480nm/520nm）で測定します。