●小型回転培養機（ローテーター）
●密閉式超音波細胞破砕装置 コスモ・バイオ社 Bioruptor
UCD-200TMなど（1.5 mlチューブを同時に６本処理できます）
●PCR DNA増幅装置
技術情報
クロマチン免疫沈降法プロトコール
記事ID ： 5160
3. 準備するもの
メーカー名：
1) 機器
■使用した抗体
- Anti-acetyl-Histone H3 (Merck Millipore, #06-599)
- Anti-acetyl-Histone H4 (Merck Millipore, #06-866)
- Normal Rabbit IgG (Santa Cruz Biotechnology, Inc. 品番：sc-2027)※ChIPのコントロール抗体として使用
■ 11 X fixation solution
| （最終濃度） | ||
| 37% formaldehyde | 3 mＬ | (11.1%) |
| 1 M HEPES (pH 8.0) | 0.5 mＬ | (50 mM) |
| 5 M NaCl | 0.2 mＬ | (100 mM) |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | 20 μＬ | (1 mM) |
| 0.1 M EGTA (pH ?) | 50 μＬ | (0.5 mM) |
| H2O | 6.23 mＬ | |
|
|
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| total | 10 mL | |
| formaldehyde抜きの溶液を作っておき、使用時にformaldehydeを加えます。 室温で保存。 |
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■ 1.5 M glycine
■FACS solution
| （最終濃度） | ||
| 1 x PBS(-) | 487.5 mＬ | |
| bovine serum | 10 mＬ | (2%) |
| 10% NaN3 | 2.5 mＬ | (0.05%) |
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| total | 500 mL | |
| 4℃にて保存。 | ||
■ SDS lysis buffer
| （最終濃度） | ||
| 1 M Tris-HCl (pH 8.0) | 2.5 mＬ | (50 mM) |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | 1 mＬ | (10 mM) |
| 10% SDS | 5 mＬ | (1%) |
| PMSF | ||
| aprotinin | ||
| leupeptin | ||
| H2O | 41.5 mＬ | |
|
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| total | 50 mL | |
| PMSF、aprotinin、leupeptinを除いたものを室温で保存。 PMSF、aprotinin、leupeptinは使用時に加えましょう。 |
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■ ChIP dilution buffer
| （最終濃度） | ||
| 1 M Tris-HCl (pH 8.0) | 2.5 mＬ | (50 mM) |
| 5 M NaCl | 1.67 mＬ | (167 mM) |
| 10% Triton X-100 | 5.5 mＬ | (1.1%) |
| 10% sodium deoxycholate | 0.55 mL | (0.11%) |
| PMSF | ||
| aprotinin | ||
| leupeptin | ||
| H2O | 39.78 mＬ | |
|
|
||
| total | 50 mL | |
| PMSF、aprotinin、leupeptinを除いたものを室温で保存。 PMSF、aprotinin、leupeptinは使用時に加えましょう。 |
||
■ 2 X RIPA buffer
| （最終濃度） | ||
| 1 M Tris-HCl (pH 8.0) | 5 mＬ | (100 mM) |
| 5 M NaCl | 3 mＬ | (300 mM) |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | 0.2 mL | (2 mM) |
| 10% Triton X-100 | 10 mＬ | (2%) |
| 10% SDS | 1 mL | (0.2%) |
| 10% sodium deoxycholate | 1 mL | (0.2%) |
| H2O | 29.8 mＬ | |
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|
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| total | 50 mL | |
| 室温で保存。 | ||
■ 1 X RIPA buffer/ 150 mM NaCl
| （最終濃度） | ||
| 2 X RIPA buffer | 25 mＬ | (1 X ) |
| H2O | 25 mＬ | |
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|
||
| total | 50 mL | |
| NaCl濃度は最終的に150 mM。 | ||
■ 1 X RIPA buffer/ 500 mM NaCl
| （最終濃度） | ||
| 2 X RIPA buffer | 25 mＬ | (1 X ) |
| 5 M NaCl | 3.5 mＬ | (350 mM) |
| H2O | 21.5 mＬ | |
|
|
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| total | 50 mL | |
| NaCl濃度は最終的に500 mM。 | ||
■ 1 X RIPA buffer/ salmon sperm DNA
| （最終濃度） | |||
| 2 X RIPA buffer | 25 mＬ | (1 X ) | |
| 5 mg/ml salmon sperm DNA | 1 mＬ | (100 μg/ml) | （超音波処理＋加熱処理済のもの） |
| 10% NaN3 | 250μL | (0.05%) | |
| H2O | 23.75 mＬ | ||
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| total | 50 mL | ||
| 4℃にて保存。 | |||
■ 50% Protein G Sepharose®/ salmon sperm DNA slurry
|
Protein G Sepharose® 4 Fast Flow (Amersham Biosciences社 Catalog #17-0618)を1 X RIPA buffer/ 150 mM NaClで２回洗浄します。その後、1 X RIPA buffer/ salmon sperm DNAに懸濁し、ローテーターを用いて4℃にて一晩攪拌。50% slurryとなるように、シリコナイズチューブに分注し、4℃にて保存。 SEPHAROSE®はGE Healthcare社の登録商標です。 |
■ LiCl wash solution
| （最終濃度） | ||
| 1 M Tris-HCl (pH 8.0) | 0.5 mＬ | (10 mM) |
| 5 M LiCl | 2.5 mＬ | (0.25 M) |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | 0.1 mL | (1 mM) |
| 10% NP40 | 2.5 mL | (0.5%) |
| 10% sodium deoxycholate | 2.5 mL | (0.5%) |
| H2O | 41.9 mＬ | |
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| total | 50 mL | |
| 室温で保存。 | ||
■ ChIP direct elution buffer
| （最終濃度） | ||
| 1 M Tris-HCl (pH 8.0) | 0.5 mＬ | (10 mM) |
| 5 M NaCl | 3 mＬ | (300 mM) |
| 0.5 M EDTA (pH 8.0) | 0.5 mL | (5 mM) |
| 10% SDS | 2.5 mL | (0.5%) |
| H2O | 43.5 mＬ | |
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| total | 50 mL | |
| 室温で保存。 | ||
■ 1 x TE
■ 4 mg/mL DNase-free RNase A
■ 10 mg/mL proteinase K
■ 20 mg/mL glycogen
■ シリコナイズチューブ
■ フェノール／CIAA
この技術情報は、生田 宏一先生1)、縣 保年先生2)よりご提供いただきました。
1) 京都大学ウイルス研究所 生体応答学研究部門 生体防御研究分野
2) 京都大学大学院医学研究科 先端領域融合医学研究機構
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商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては
使用しないように、十分ご注意ください。
