1.　Labiaseの防菌効果に関する資料

【商品情報】　乳酸菌細胞壁溶解酵素 Labiase

Labiaseの溶菌スペクトルを、対象菌に対する溶菌活性を測定することで検討した。Labiaseの溶菌活性を対象菌の菌体懸濁液の、濁度の減少と見なし、以下の方法で濁度減少率を測定した。対象菌菌体（対数増殖期）懸濁液の濁度（ＯＤ６６０）が１．０、Labiaseが０．２５％に最終的になるようにMcIlvain緩衝液（ｐＨ４．０）で調製し、２時間反応後の反応液の濁度を測定した。コントロールとしてLabiaseを除いて同様に調製したものの濁度も、同様にして測定した。溶解率は下式により求めた。結果を表１に示す。

【式】

ｄ（０，ｔ）：０，ｔ　hr後の反応液の濁度
Ｄ（０，ｔ）：０，ｔ　hr後のコントロールの濁度

【表１】

表１から明らかなように、Labiaseはグラム陽性細菌（乳酸菌、火落菌等）のみならず、グラム陰性細菌（大腸菌、Pseudomonas属等）もよく溶菌し、幅広い溶菌スペクトルを持っているということがわかった。特に清酒などの火落ちの原因菌である火落菌、食中毒の原因菌の一つであるとされているStaphylococcus aureus IFO12732また、う蝕細菌であるStreptococcus mutans JCM5705をよく溶解し、火落ち予防、食中毒予防さらに虫歯予防への用途が考えられた。

Labiaseのアルコール存在下での溶菌活性を検討するために、[1]の実験と同様の反応系に、エタノールを１５％存在させた場合と、存在させなかった場合の乳酸菌及び火落菌の溶解率を検討し、比較した。結果を表２に示す。

【表２】

表２より明らかなように、Labiaseの溶菌活性は、エタノールが少なくても１５％存在していても存在していない時と全く遜色がなかった。つまり、Labiaseは、アルコール濃度１５％以下である清酒や、ビールなどのアルコール飲料に直接作用させても、溶菌活性は十分に効果が有るということが分かった。

濾過滅菌したLabiaseの水溶液を、オートクレーブ済みの一般細菌用培地であるブレインハートインヒュージョンブイヨン「ニッスイ」（日水製薬（株）製）に最終濃度０．２５％になるように添加したものと、Labiaseの水溶液の代わりに滅菌した蒸留水を加えたものに、１白金耳の食中毒の原因菌である黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus IFO12732）を植菌し、３７℃で２４時間、振盪培養したときの濁度（ＯＤ６６０）の経時変化を比較した。比較として卵白リゾチーム（シグマ社製）を最終濃度０．２５％となるように、同様に添加した場合も行った。結果を図１に示す。

【図1】

例えば、吸光度変化が起こるまでは、静菌効果があったということにすると、図１から明らかなように、無添加区分と比較して、卵白リゾチームを培地に０．２５％になるように添加した場合、約２時間の静菌効果がみられ、Labiaseを同量添加した場合においては、約６時間の静菌効果があった。よって、Labiaseを食品などに作用させれば、食中毒の原因である細菌の増殖を抑えることができる。またその効果は、防腐剤として以前から用いられている卵白リゾチームと比較してはるかに高かった。

濾過滅菌したLabiaseの水溶液を、オートクレーブ済みのＳＩ培地（１％酵母エキス、０．５％ポリペプトン、２．５％グルコース、１％酢酸ナトリウム、０．０１％硫酸マグネシウム、０．０００２５％硫酸マンガン、０．０００２５％硫酸第一鉄、０．００５％メバロン酸、１０％エタノール、ｐＨ５．１）に最終濃度０．２５％、０．１２５％及び、０．０２５％になるように添加したものと、Labiaseの水溶液の代わりに滅菌した蒸留水を加えたものに、１白金耳の火落菌（Ｓ２４）を植菌し、３０℃で１２０時間、静置培養したときの濁度（ＯＤ６６０）の経時変化を比較した。比較として卵白リゾチーム（シグマ社製）を最終濃度０．２５％となるように、同様に添加した場合も行った。結果を図２に示す。

【図2】

図２から明らかなように、無添加区分と比較して、Labiaseを培地に添加した区分は、いずれの場合においても火落菌Ｓ２４の増殖が全く見られず、顕著な火落菌に対する増殖阻害効果があった。一方、卵白リゾチームには、ほとんど火落菌への増殖阻害効果はみられなかった。また他の火落菌に関しても同様の検討を行ったが、いずれの場合においても同様の結果であった。また本検討は、１０％エタノールの存在下で行っており、Labiaseの増殖阻害効果は少なくとも１０％エタノールの存在下においても有効であるということが判明した。よって、Labiaseを作用させることによって、清酒やビールをはじめとするアルコール飲料の火落ち及び乳酸菌による雑菌汚染を防止できる。

濾過滅菌したLabiaseの水溶液を、オートクレーブ済みの一般細菌用培地であるブレインハートインヒュージョンブイヨン「ニッスイ」（日水製薬（株）製）に最終濃度０．２５％、０．１２５％及び、０．０２５％になるように添加したものと、Labiaseの水溶液の代わりに滅菌した蒸留水を加えたものに、１白金耳の虫歯の原因菌であるう蝕細菌（S.mutans JCM5705）を植菌し、３７℃で２４時間、静置培養したときの濁度（ＯＤ６６０）の経時変化を比較した。比較として卵白リゾチーム（シグマ社製）を最終濃度０．２５％となるように、同様に添加した場合も行った。結果を図３に示す。

【図3】

図３から明らかなように、無添加区分と比較して、Labiaseを培地に添加した区分は、いずれの場合においても、う蝕細菌（S.mutans JCM5705）の増殖が全く見られず、顕著なう蝕細菌に対する増殖阻害効果があった。一方、卵白リゾチームには、全くう蝕細菌への増殖阻害効果はみられなかった。よって、Labiaseを例えば、ねり歯磨き、粉状歯磨き、マウスウオッシュ等に混合することによって、虫歯の原因の一つであるう蝕細菌の増殖を抑え、虫歯予防剤として利用できるということが分かった。

試験[3]、試験[4]及び試験[5]で行った方法と同様にして、Labiaseの最終濃度が０．２５％になる場合において、培地に添加する前に加熱処理（沸騰水中、１５分間）したものと、していないものとのそれぞれの菌体に対する増殖抑制効果を検討し、比較した。結果を図４、図５及び図６に示す。
なお、本試験は、Labiase中に存在する溶菌活性を熱によって完全に失活させて（確認済み）、Labiaseの微生物の増殖阻害効果が溶菌活性単独によるものか、もしくは全く別の微生物に対する増殖阻害活性を有する物質によるものかを明らかにするために行ったものである。

【図4】

図４から明らかなように、加熱処理を行って酵素を失活させても３時間程度の静菌効果があったことより、Labiaseの黄色ブドウ球菌に対する増殖阻害効果は、溶菌活性だけでなく他の増殖阻害効果を持った物質も効いているということが分かった。

【図5】

また図５の火落菌（Ｓ２４）の場合においては、加熱処理の有無に関わらず、少なくとも１２０時間は完全に火落菌の増殖を阻害しており、Labiaseの溶菌活性以外の物質が効いているということがわかった。

【図6】

また図６のう蝕細菌の場合においても、加熱によってある程度の増殖阻害効果の低下が見られるものの、完全に効果を失わないという結果を得た。よってS.mutansの場合においても、Labiaseの溶菌活性以外で、増殖阻害効果を持った未知の物質の存在が示唆される結果となった。

 以上３つの結果により、Labiaseの増殖阻害効果は、その対象となる菌株によって多少異なるが、細胞壁溶解酵素の溶菌活性のみが働いているのではなく、Labiase中に含まれる未知の物質との協奏効果によるものであることが判明した。このことは、Labiaseの生産菌であるS.fuluvisimmus が放線菌であり、抗菌物質を生産している可能性が高いということ、また本酵素は、精製をほとんど行なっていない複合酵素剤ということから、充分予想しうることであった。またLabiaseの防菌効果は、熱に対して非常に安定であるといえる。

以上

なお、上記内容については現在特許出願中。