2.　LabiaseのDNase活性に関する資料

【商品情報】　乳酸菌細胞壁溶解酵素 Labiase

以前行ったLabiaseに関するアンケートにおいてその用途についてたずねたところ、乳酸菌のゲノム、プラスミドDNAの調製に使うという意見が圧倒的に多かった。そこでLabaseのDNA分解活性について検討することにした。

【方法】

1．McIlvain buffer（ｐH4.0）を用いて、0.5％Labiase溶液を調製する。

２．0.5％Labiase溶液50μlに基質となるDNAを1μg添加する。

３．反応液を5本用意し、そのうちの2本は30℃で1hr加温し、別の2本は4hr加温する。また残りの1本は、0timeのBlankとして全く加温しない。

４．上記の5サンプルについてPhe/Cl処理を２回、EtOH沈殿−洗浄操作を１回行う。

５．Dry up後、45μlのTEに溶解し、5μlの10X Loading bufferを添加して、0.8％アガロースゲル電気泳動を行う。

なお、検討はLot no. JJAD1とLot no. AAAC2について行った。

【結果】

	（判定）  Lot no. JJAD1についてDNase活性チェックを行ったところ、左図のようにEndo-,Exo-ともにBlankで見られたバンドが消失しており、明らかにDNase活性が存在していた。
	（判定）  Lot no. AAAC2についても同様に、DNase活性チェックを行ったが、前結果と同様に、Endo-,Exo-ともにBlankで見られたバンドが消失しており、明らかにDNase活性が存在していた。

前述の試験結果よりLabiaseにはDNA分解活性が存在しており、Labiaseを用いて乳酸菌からゲノム、プラスミドDNAを調製する際には、その活性を阻害しておかなければならないということがわかった。そこで、DNaseを阻害する物質として一般的なEDTAを用いてLabiaseのそれが阻害できるかどうか検討を行った。

【方法】

1．McIlvain buffer（ｐH4.0）を用いて、0.5％Labiase溶液を調製する。

２．0.5％Labiase溶液45μlにEDTAを最終濃度5mM、25mMもしくは50mMとなるように添加する（阻害しない時は蒸留水）。その溶液に基質となるDNAを1μg添加する。

３．反応液を3本用意し、そのうちの1本は30℃で1hr加温し、別の1本は4hr加温する。また残りの1本は、0timeのBlankとして全く加温しない。

４．上記の3サンプルについてPhe/Cl処理を２回、EtOH沈殿−洗浄操作を１回行う。

５．Dry up後、45μlのTEに溶解し、5μlの10X Loading bufferを添加して、0.8％アガロースゲル電気泳動を行う。

なお、検討はLot no. AAAC2についてのみ行った。

【結果】

以下に阻害無しの場合と、5mM EDTAで阻害した場合の結果を示す。

上の２枚の写真を比較すると、EDTAがない場合はやはりBlankで存在していたバンドが４hr後には完全に消失いていたが、５mM のEDTAを反応液中に存在させておくと、DNAの分解は一切見られなかった。なお、最終濃度が25mM,50mMの時も同様の結果であった。
よって上記の結果よりLabiaseに含まれる両DNase活性（Endonuclease,Exonuclease）は、反応液中に少なくとも5mM以上のEDTAが存在していれば完全に阻害されるということがわかった。