甲状腺ホルモン受容体コアクチベーターの結合の低分子阻害物質を同定するためのハイスループットスクリーニング法

Sci. STKE, Vol. 2006, Issue 341, pp. pl3, 27 June 2006
[DOI: 10.1126/stke.3412006pl3]

Ru Feng Wu and Lance S. Terada*

Leggy A. Arnold^1*, Eva Estebanez-Perpina², Marie Togashi³, Anang Shelat¹, Cory A. Ocasio⁴, Andrea C. McReynolds⁵, Phuong Nguyen3, John D. Baxter³, Robert J. Fletterick², Paul Webb³, and R. Kiplin Guy^1
1 St. Jude Children’s Research Hospital, Department of Chemical Biology and Therapeutics, 333 North Lauderdale Street, Memphis, TN 38105, USA.
² University of California San Francisco, Department Biochemistry and Biophysics, 600 Sixteenth Street, San Francisco, CA 94143, USA.
³ University of California San Francisco, Diabetes Center and Department of Medicine, HSW 1210, 513 Parnassus Avenue, San Francisco, CA 94122, USA.
⁴ University of California, San Francisco, Department of Pharmaceutical Chemistry, 600 Sixteenth Street, San Francisco, CA 94143, USA.
⁵ University of California, San Francisco, Department of Pharmaceutical Chemistry, 1700 Fourth Street, Room 509, San Francisco, CA 94143, USA.

要約 : 甲状腺ホルモン（T3）がその受容体（TR）に結合することによって開始される遺伝子の転写を調節する代替法を提供するために、TRとその転写コアクチベーターの相互作用の阻害物質を発見するためのハイスループット法を開発した。このスクリーニング法は蛍光偏光（fluorescence polarization: FP）に基づいており、これはタンパク質間相互作用の研究のためのもっとも高感度かつ頑強なハイスループット法のひとつである。蛍光標識したコアクチベーターを偏光で励起する。放出された偏光は、標識コアクチベーターの分子特性の関数であり、特にブラウン分子回転（Brownian molecular rotation）は、標識複合体の分子量の変化に極めて敏感である。低分子存在下におけるホルモン受容体の蛍光標識コアクチベーターペプチドからの解離はこの競合法で検出でき、アッセイはハイスループットスクリーニングの形式で実施することができる。この方法で同定したヒット化合物は、用量反応分析、半定量的なグルタチオン-S-トランスフェラーゼアッセイ、ホルモン置換アッセイ（hormone displacement assay）を含む、複数の2次アッセイ法で評価される。それに続くin vitroの転写アッセイによって、T3存在下で低分子の低いマイクロモル濃度における甲状腺ホルモンのシグナル伝達の阻害を検出できる。