ELISAキット

ELISA(Enzyme Linked Immunosolvent Assay)は、抗原抗体反応を利用して微量生体物質を定量する方法で、バイオテクノロジー分野で最も広く用いられています。測定はマイクロプレート上で行われ、サンドイッチ法（図１）もしくは競合法（図2）によって、対象物質を定量します。

■ 直接法

標識済みの抗体（或いは抗原＝検出対象）を反応させる1-step 法。

■ 間接法

検出対象と反応する非標識一次抗体と標識二次抗体を用いた2-step 法。

一般的な酵素は無色の基質を有色の物質へと変換させます。ELISAには可溶性生成物を生産する基質を使用します。

例えば、アルカリフォスファターゼ（ALP）により黄色の p-nitrophenol へ変換される p-nitrophenylphosphate （pNPP）などがあります。西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）と一緒に使用される基質は、それぞれ緑色、オレンジ色、青色を発する 2, 2'-azo-bis（3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid）（ABTS）、o-phenylenediamine（OPD） および 3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidine base（TMB）などがあります。

上記比色定量用の基質でなく、化学発光基質、蛍光基質が使用されることもあります。抗体をビオチン（Biotin）化しておき、酵素で標識されたアビジン（Avidin）あるいはストレプトアビジンを用いることもあります。

■ サンドイッチ法（図1）

測定対象となる標的物質を、2種類の抗体で挟むこと（サンドイッチ）によって測定する方法です。
抗原を異なる2つの抗体で捕捉・検出するので特異性が高く感度も高い方法です。

図1 サンドイッチ法ELISAのプロトコール

検出抗体が酵素標識されているものを使用する Direct sandwich ELISA,
検出抗体が酵素標識されておらず、さらに二次検出抗体を必要とする Indirect sandwich ELISA にわけられます。

■ 競合法（図2）

抗原あるいは抗体の標識体と非標識体を共存させ、抗原抗体反応の競合阻害によって、生じた吸光度の減少度合から定量する方法です。抗体の結合部位が一カ所しかないものや、小さい分子を測定することができます。

※競合法ELISAはサンプルまたはスタンダードにおける抗原が多いほど、測定値は低くなりますので、サンドイッチ 法ELISAとは逆の曲線を描きます。

図2 競合法ELISAのプロトコール

■ 直接吸着法

プレート（固相）に抗原を直接吸着させ、酵素標識抗体により検出する方法。

■ Cell-based ELISA

プレート上で培養した細胞に刺激/阻害等の処理をし、抗原特異的一次抗体、標識二次抗体を反応させます。細胞ライセートの調製が不要です。様々な阻害剤／活性化因子の効果を一度にスクリーニング可能です。

• CSB（WUHAN HUAMEI BIOTECH）社
• RBT（RayBiotech）社
• LSP（LifeSpan Biosciences）社
• ENZ（Enzo Life Sciences）社

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