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ELISAキット

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ELISA(Enzyme Linked Immunosolvent Assay)は、抗原抗体反応を利用して微量生体物質を定量する方法で、バイオテクノロジー分野で最も広く用いられています。測定はマイクロプレート上で行われ、サンドイッチ法(図1)もしくは競合法(図2)によって、対象物質を定量します。

直接法と間接法

■ 直接法

標識済みの抗体(或いは抗原=検出対象)を反応させる1-step 法。

メリット デメリット
  • 二次抗体を必要としないため手順が少なく短時間で行える
  • 直接標識を自身で行う場合、手間がかかる
  • 販売されている標識済み抗体の種類が多くない
  • 間接法のようなシグナル増幅がみられない

■ 間接法

検出対象と反応する非標識一次抗体と標識二次抗体を用いた2-step 法。

メリット デメリット
  • 一次抗体に複数の標識二次抗体が結合できるので感度があがる(シグナルの増幅が容易)
  • 一次抗体の種類同一の標識二次抗体を検出に使用できるため汎用性がある
  • 二次抗体による非特異的結合が生じる可能性がある
  • 直接法より時間がかかる

ELISAに利用される酵素と基質

一般的な酵素は無色の基質を有色の物質へと変換させます。ELISAには可溶性生成物を生産する基質を使用します。

例えば、アルカリフォスファターゼ(ALP)により黄色の p-nitrophenol へ変換される p-nitrophenylphosphate (pNPP)などがあります。

西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)と一緒に使用される基質は、それぞれ緑色、オレンジ色、青色を発する 2, 2'-azo-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS)、o-phenylenediamine(OPD) および 3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidine base(TMB)などがあります。

上記比色定量用の基質でなく、化学発光基質、蛍光基質が使用されることもあります。

抗体をビオチン(Biotin)化しておき、酵素で標識されたアビジン(Avidin)あるいはストレプトアビジンを用いることもあります。

ELISAのフォーマット

■ サンドイッチ法(図1)

測定対象となる標的物質を、2種類の抗体で挟むこと(サンドイッチ)によって測定する方法です。
抗原を異なる2つの抗体で捕捉・検出するので特異性が高く感度も高い方法です。

サンドイッチ法ELISAのプロトコール

図1 サンドイッチ法ELISAのプロトコール

検出抗体が酵素標識されているものを使用する Direct sandwich ELISA,
検出抗体が酵素標識されておらず、さらに二次検出抗体を必要とする Indirect sandwich ELISA にわけられます。

[ディベロップメント(抗体ペア+スタンダード商品)]

サンドイッチ法での測定に必要な2種類の抗体とスタンダードが含まれています。
お客様自身が、抗体をプレートに結合させるモジュールタイプの商品です。1セットで数プレート分相当の抗体が含まれており、大量のサンプルを低コストで処理する場合に適しています。

 

■ 競合法(図2)

抗原あるいは抗体の標識体と非標識体を共存させ、抗原抗体反応の競合阻害によって、生じた吸光度の減少度合から定量する方法です。
抗体の結合部位が一カ所しかないものや、小さい分子を測定することができます。

※競合法ELISAはサンプルまたはスタンダードにおける抗原が多いほど、測定値は低くなりますので、サンドイッチ 法ELISAとは逆の曲線を描きます。

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図2 競合法ELISAのプロトコール

 

■ 直接吸着法

プレート(固相)に抗原を直接吸着させ、酵素標識抗体により検出する方法。

 

■ Cell-based ELISA

プレート上で培養した細胞に刺激/阻害等の処理をし、抗原特異的一次抗体、標識二次抗体を反応させます。
細胞ライセートの調製が不要です。
様々な阻害剤/活性化因子の効果を一度にスクリーニング可能です。

 

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