記事ID ： 12706

リポタンパク質の代謝研究に脂質抽出キット（クロロホルムフリー）

メーカー名：Cell Biolabs, Inc.

脂質抽出キット（Lipid Extraction Kit）は、従来法（Folch法など）の欠点を解消し、有害なクロロホルムを使用しない抽出キットです。血漿、血清、培養細胞サンプル由来の脂質を抽出できます。有機層が上層に来ることから、脂質画分の回収が容易で、ハイスループットなリキッドハンドリングシステムにも対応します。

背景

脂質抽出法

脂質（Lipids）は、モノグリセリドやジグリセリド、トリグリセリド、脂肪、ステロール、およびその他を含む多様な分子グループの総称です。脂質は、細胞膜の完全性を維持するだけではなく、膜輸送やシグナル伝達、アポトーシス、エネルギー貯蔵などの細胞プロセスに関与しています。脂質の代謝の摂動は、癌、糖尿病、アルツハイマー病、冠動脈性心疾患などの多くの疾患に関連します。

脂質を研究するためには、しばしば組織や培養細胞からの抽出操作が必要になります。
従来、フォルチ法（Folch法［1］）がよく用いられていますが、Folch法はいくつかの欠点を有しています。1点目は、抽出する脂質が下層の有機層に含まれることで、精製中に上層のタンパク質含有相を通過しなくてはならず、脂質サンプルへのコンタミネーションが引き起こされます。結果として得られる低純度の脂質サンプルは、HPLCなどの装置を詰まらせ、下流の脂質分析を妨害する場合があります。2点目として、Folch法では有機相溶媒としてクロロホルムを使用していることです。吸引によるクロロホルムの長期暴露は、肝炎や黄疸など、肝臓に影響をもたらします。また、クロロホルムは発癌性を持つことが動物で実証されており、腎臓や肝臓腫瘍の発生を増加させます。実際に、米国環境保護庁（EPA）では、クロロホルムはグループB2（発癌性物質2：ヒトで発癌性を持つ可能性が高い）に分類されています。

特長

クロロホルムフリーの有機抽出法
血漿、血清、培養細胞から脂質を抽出できます
上層の有機層に抽出され、ハイスループットのアプリケーションにも適しています

構成内容

脂質抽出試薬 A
脂質抽出試薬 B
脂質抽出試薬 C

プロトコール

100 μL の血清、血漿、細胞懸濁液、または全組織ホモジネートをチューブに入れる
500 µL の脂質抽出試薬 A を加え、10分間ボルテックス
（チューブシェーカーまたはボルテックスを推奨）
250 µL の脂質抽出試薬 B を加え、5分間ボルテックス
250 µL の脂質抽出試薬 B を加え、5分間ボルテックス
500 µL の脂質抽出試薬 C を加え、5分間ボルテックス
5分間遠心（1000 x g）
脂質を含む上層の有機層を慎重に新しいチューブに移す
残っている下層の水層に 530 µL の脂質抽出試薬 B を加え、5分間ボルテックス
5分間遠心（1000 x g）
脂質を含む上層の有機層を慎重に取り出し、ステップ7の有機層にプールする
残っている下層の水層に 420 µL の脂質抽出試薬 B を加え、5分間ボルテックス
5分間遠心（1000 x g）
脂質を含む上層の有機層を慎重に取り出し、最初の2つの有機層にプールする
有機層をプールしたチューブを開けた状態で、真空濃縮器（vacuum concentrator）中または37ºCの乾燥インキュベーター中で、一晩（または乾燥するまで）乾燥させる
ブタノールやシクロヘキサンなどの有機溶媒で脂質抽出物を再懸濁

上記プロトコルは、100μL のサンプルサイズについて記載しています。他のサンプル容量で実施するときは、それぞれの抽出試薬の量について以下の表1を参照ください。

表1．様々なサンプルサイズでの試薬調製容量
サンプル容量	100 μL	500 μL	1 mL
ステップ 2: 脂質抽出試薬 A	500 μL	2.5 mL	5 mL
ステップ 3: 脂質抽出試薬 B	250 μL	1.25 mL	2.5 mL
ステップ 4: 脂質抽出試薬 B	250 μL	1.25 mL	2.5 mL
ステップ 5: 脂質抽出試薬 C	500 μL	2.5 mL	5 mL
ステップ 8: 脂質抽出試薬 B	530 μL	2.65 mL	5.3 mL
ステップ 11: 脂質抽出試薬 B	420 μL	2.1 mL	4.2 mL

使用例

図1　抽出した脂質を使用したトータルコレステロールアッセイ（品番： STA-390）
（A）コレステロールスタンダードカーブ
（B）脂質はウシ胎児血清（FBS）／HEK293細胞から、Folch法（青のバー）／本キット（赤のバー）を使用して調製した。アッセイプロトコールに従って、コレステロール量を測定した。

図2　抽出した脂質を使用した遊離脂肪酸アッセイ（品番： STA-619）
（A）遊離脂肪酸（FFA）スタンダードカーブ
（B）脂質はウシ胎児血清（FBS）／HEK293細胞から、Folch法（青のバー）／本キット（赤のバー）を使用して調製した。アッセイプロトコールに従って、FFA量を測定した。

図3　抽出した脂質を使用したホスファチジルコリンアッセイ（品番： STA-600）
（A）ホスファチジルコリン（PC）スタンダードカーブ
（B）脂質はウシ胎児血清（FBS）／HEK293細胞から、Folch法（青のバー）／本キット（赤のバー）を使用して調製した。アッセイプロトコールに従って、ホスファチジルコリン量を測定した。

参考文献

Folch J, Lees M, and Slone Stanley GH (1956) J. Biol. Chem. 226, 497-509.

脂質抽出キット（クロロホルムフリー）

品名	メーカー	品番	包装	希望販売価格
Lipid Extraction Kit (Chloroform-Free)	CBL	STA-612	50 PREP.	お問い合わせ
Lipid Extraction Kit (Chloroform-Free), Trial Size	CBL	STA-612-T	10 PREP.	販売終了