構築済sgRNAコンストラクト、構築済HDRドナーコンストラクトをゲノムワイドにご提供！ GeneCopoeia社 CRISPR-Cas9 ノックアウトシステム

下表のベクターにsgRNAを構築したコンストラクトを、ヒト、マウス、ラットの全遺伝子を網羅してご用意しています。

sgRNAクローンはcrRNAとtracrRNAからなる一本鎖キメラsgRNAを発現します。同時にトランスフェクションしたCas9エンドヌクレアーゼの存在下でsgRNAが標的DNA配列を認識し、Cas9ヌクレアーゼを先導してDSB（DNA二本鎖切断）を産生し、遺伝子ノックアウト、ノックイン、変異を誘発します。複数のsgRNAクローンを構築してCas9クローンと同時にトランスフェクションし、ゲノム上の複数部位を同時に編集することも可能であり、より効果が高く自由度の高い実験デザインが可能です。

※本製品はGCP社の野生型あるいはニッカーゼ改変型 構築済 sgRNAコンストラクトと組み合わせてご使用いただけます。

下表のベクターに、標的遺伝子用sgRNAコンストラクトがDSB（DNA二本鎖切断）を導入する位置に合わせて設計したホモロジーアームと蛍光や薬剤耐性遺伝子などを組み込んだコンストラクトを、ヒト、マウス、ラットの全遺伝子を網羅してご用意しています。

Cas9クローンは、ヒトコドンに最適化済みの野生型Cas9ヌクレアーゼ（化膿レンサ球菌）を発現します。ニッカーゼ改変型Cas9クローンは第10位のアミノ酸をアスパラギン酸からアラニンへと置換（D10A）させたCas9変異体を発現します。Cas9ヌクレアーゼは単鎖ガイドRNA（sgRNA）とともに、直後にN-G-Gプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）をもつ20塩基標的部位において部位特異的二本鎖切断（DSB）を産生します。DSB（DNA二本鎖切断）は、誤りを犯しがちでこれがフレームシフト変異につながる非相同性末端結合（NHEJ）、あるいは、修復テンプレート存在下では相同組換え（HR、HDR）により修復されます。CRISPR-Cas9技術は、DSB（DNA二本鎖切断）を高頻度で誘導することから、数々の実験システムにおいて遺伝子ノックアウトや、点変異、レポーターやその他の修正のノックインに利用されています。Cas9 D10Aニッカーゼは野生型Cas9と同様の認識システムを利用しますが、こちらは通常NHEJやHRにより修復されない一本鎖の「ニック」のみを生ずる点が異なります。2種のsgRNAが正しい方向性をもって、期待する部位に隣接する両鎖をそれぞれ標的した場合、DSB（DNA二本鎖切断）が生じてNHEJや相同組換え（HR、HDR）による効率のよい修復を受けることになります。

図.2　CRISPR-Cas9による遺伝子工学
（左）sgRNAに先導されたCas9ヌクレアーゼにより生じたDSBのNHEJによる修復
（右）sgRNAに先導されたCas9ヌクレアーゼにより生じたDSBのHRによる修復とこれに伴うドナープラスミドからの期待する遺伝子または選択マーカー（他の遺伝要素など）の挿入

図.3　結合した側鎖に位置本鎖切断を生ずるCas9ニッカーゼの模式図

図.4　HEK293T細胞を用いたHUWE I-sgRNA/Cas9によるHUWE I 遺伝子標的
(A) HUWE I-sgRNAとゲノムDNA PCRプライマーデザイン
(B) 6ウェルプレートを用いてHEK293T細胞にHUWE I-sgRNAクローン（レーン１）またはスクランブルsgRNA/Cas9コントロールクローン（レーン2）をトランスフェクションした。トランスフェクションから40時間後に細胞を回収した。ゲノムDNAを抽出後、HUWE特異的PCRプライマーを用いてPCR増幅した。PCR産物はゲル精製した。8uLの精製済みPCR産物をバッファーと混合後、変性と再アニーリングを行い、37℃で60分間T7エンドヌクレアーゼI（ENI）処理した。HUWE PCR産物サイズは520bpであり、予想されるT7 ENI処理産物サイズは330bpと190bpである。

図.5　複数遺伝子を標的としたCRISPR-Cas9マルチプレキシング
HEK293T GFP安定発現細胞にCas9発現プラスミドとp53, HUWE1, NCL3およびGFPを標的とする複数のsgRNAs（レーン1~4）またはスクランブルsgRNA（レーン5~8）を同時にトランスフェクションした。ゲノムDNAを抽出し、複数の標的部位に挿入欠損が存在するかT7エンドヌクレアーゼI（ENI）アッセイを行って確認した。"＊"はCas9と複数sgRNAsにより各標的部位に効率的に挿入欠損が導入されたことを示す（レーン1~4）。
PCR産物サイズとT7 ENI切断産物サイズ：GFP: 720bp (未処理), 340bp + 380bp (切断後); NCL3: 765bp (未処理), 295bp +470bp (切断後); HUWE: 520bp (未処理), 190bp + 330bp (切断後); P53: 825bp (未処理), 475bp + 350bp (切断後).