商品情報

記事ID : 15479
研究用

構築済sgRNAコンストラクト、構築済HDRドナーコンストラクトをゲノムワイドにご提供!GeneCopoeia社 CRISPR-Cas9 ノックアウトシステム

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GeneCopoeia(GCP)社では、sgRNA(gRNA、ガイドRNA)コンストラクトおよびHDR(HR、相同組換え)機構を利用したノックアウトにおけるクローンセレクション に使用するドナークローンについて、ヒト・マウス・ラットをゲノムワイドに網羅した商品をご提供しております。

sgRNA(gRNA、ガイドRNA)コンストラクトは、非ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レンチウイルス粒子の3種の形態をご用意しており、野生型Cas9あるいはニッカーゼ改変型Cas9と組み合わせて使用するセパレートタイプと、野生型Cas9とsgRNA(gRNA、ガイドRNA)とを1つのベクターで同時に発現するAll-in-oneタイプ(非ウイルスベクター)よりお選びいただけます。

HDR機構を利用したノックアウトアプリケーションに、sgRNAコンストラクトおよび野生型あるいはニッカーゼ改変型Cas9と組合せてご利用いただけるドナークローンは、GFPや薬剤耐性遺伝子をDSB(DNA二本鎖切断)導入位置にノックインします。13種類ものベクター骨格よりお好みの商品をお選びいただけます。

Cas9は、野生型およびニッカーゼ改変型Cas9をご用意しており、非ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レンチウイルス粒子(野生型のみ)よりご選択いただくことができ、CRISPR-Cas9を利用したノックアウト実験をトータルサポートします。

背景

CRISPR-Cas9システムは、ウイルスやトランスポゾンの侵入から防御するため細菌や古細菌において進化した適応免疫です。近年、CRISPR-Cas9システムによりゼブラフィッシュ、マウス、ラット、線虫、植物および細菌といった多数の生物種において、高い効率でゲノム編集ができることが実証されました。いくつかの研究グループにより、細胞やゼブラフィッシュにおいてはジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)やTALEN(転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ)に比べ、CRISPR-Cas9介在型の方が同等またはより高い遺伝子標的効果をもつことが示されています。

II型CRISPRシステムでは、トランス活性化crRNA(tracrRNA)にアニールしたCRISPR RNA(crRNA)複合体のみで、十分にCas9エンドヌクレアーゼを特異的ゲノム配列へと先導し、標的DNAにニ本鎖切断(DSB)を産生します。そのため、crRNAとtracrRNA配列を融合し合成キメラ単鎖ガイドRNA(sgRNA)を産生させることで、本システムを簡易化することもできます。選択した標的配列はcrRNAやキメラsgRNAに対して相補的な20塩基のDNA配列と、これに続く3塩基(5'-NGG-3')のPAM(プロトスペーサー隣接モチーフ)配列からなり、これはCas9自身による認識と切断に必須な配列です。CRISPR-Cas9のRNAに先導されたDNA認識機構は、選択的ゲノム工学においてシンプルでありながら強力なツールとなり得ます。CRISPR-Cas9システムにおいて、重要な利点のひとつにCas9タンパク質がそれぞれのgRNA(sgRNA、ガイドRNA)により先導されつつ、複数のゲノム標的座位を同時に修正できることが挙げられます。

CRISPR-Cas9 によるゲノム編集概要
図.1 CRISPR/Cas9介在型ゲノム編集の模式図

特長

  • 構築済sgRNAと構築済HDRドナーコンストラクト
  • ヒト、マウス、ラット遺伝子を網羅
  • 非ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レンチウイルスをご用意
  • 野生型Cas9、ニッカーゼ改変型Cas9から選択可能
  • セパレート型、All-in-One型から選択可能
  • メチル化状態に関わらないRNA先導型ゲノムDNA認識
  • ZFNやTALENに比べ同等またはより高いゲノム編集効率
  • 複数遺伝子を同時に編集可能(マルチプレキシング)
  • シンプルかつ迅速なデザイン工程、新規標的ごとのヌクレアーゼ再設計は不要

構築済sgRNAと構築済HDRドナークローン

ヒト、マウス、ラット遺伝子を網羅した構築済sgRNAと構築済HDRドナークローンをご用意しています。

構築済sgRNA

下表のベクターにsgRNAを構築したコンストラクトを、ヒト、マウス、ラットの全遺伝子を網羅してご用意しています。

sgRNAクローンはcrRNAとtracrRNAからなる一本鎖キメラsgRNAを発現します。同時にトランスフェクションしたCas9エンドヌクレアーゼの存在下でsgRNAが標的DNA配列を認識し、Cas9ヌクレアーゼを先導してDSB(DNA二本鎖切断)を産生し、遺伝子ノックアウト、ノックイン、変異誘発などのゲノム編集機能を促進します。複数のsgRNAクローンを構築してCas9クローンと同時にトランスフェクションし、ゲノム上の複数部位を同時に編集することも可能であり、より効果が高く自由度の高い実験デザインが可能です。

 


商品形態 gRNA ベクター
野生型Cas9
(セパレート)
非ウイルスベクター 単品(gRNA1種)
セット(gRNA3種)
pCRISPR-SG01
レンチウイルスベクター pCRISPR-LvSG03
レンチウイルス粒子 pCRISPR-LvSG03
ニッカーゼ改変型Cas9
(セパレート)
非ウイルスベクター gRNAペア1種 pCRISPR-SG01
野生型Cas9
(All-in-One)
非ウイルスベクター 単品(gRNA1種) pCRISPR-CG01 or
pCRISPR-CG02
セット(gRNA3種)

※本製品はGCP社の野生型あるいはニッカーゼ改変型 構築済 sgRNAコンストラクトと組み合わせてご使用いただけます。

構築済HDRドナークローン

下表のベクターに、標的遺伝子用sgRNAコンストラクトがDSB(DNA二本鎖切断)を導入した位置に合わせて設計したホモロジーアームと蛍光や薬剤耐性遺伝子などを構築したコンストラクトを、ヒト、マウス、ラットの全遺伝子を網羅してご用意しています。

品番プロモーターレポーター
遺伝子
選択マーカーLoxPサイトベクター
マップ
pDonor-D01 EFa1 copGFP Puromycin N/A pDonor-D01
pDonor-D02 CMV copGFP Neomycin N/A pDonor-D02
pDonor-D03 CMV N/A Neomycin N/A pDonor-D03
pDonor-D04 CMV N/A Puromycin N/A pDonor-D04
pDonor-D05 EFa1 N/A Neomycin N/A pDonor-D05
pDonor-D07 EFa1 copGFP Puromycin/TK LoxP pDonor-D07
pDonor-D08 CMV copGFP Neomycin/TK LoxP pDonor-D08
pDonor-D09 EFa1 N/A Puromycin/TK LoxP pDonor-D09
pDonor-D10 CMV N/A Neomycin/TK LoxP pDonor-D10
pDonor-D11 PGK copGFP Puromycin/TK LoxP pDonor-D11
pDonor-D12 EFa1 copGFP Hygromycin/TK LoxP pDonor-D12
pDonor-D13 PGK copGFP Neomycin/TK LoxP pDonor-D13
pDonor-D14 PGK N/A Puromycin/TK LoxP pDonor-D14

商品検索方法

1.

GeneCopoeia社 CRISPR-Cas9 sgRNA/HDR donor Expression Clone 検索ページ にアクセス

2.

生物種を選択し、遺伝子名やアクセッション番号などを入力して検索

生物種を選択し、遺伝子名やアクセッション番号などを入力して検索
3.

検索結果よりご希望の遺伝子を選択

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4.

クローンの詳細情報で遺伝子名やアクセッション番号をご確認いただき、ページ下方に表示される表の品番をご利用の代理店へお伝えいただき、お見積をご依頼ください。クローンごとに価格が異なります。

クローンの詳細情報で遺伝子名やアクセッション番号をご確認いただき、お見積をご依頼ください。

コントロール

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
Scrambled sgRNA control for pCRISPR-SG01詳細データ GCP CCPCTR01-SG01-10 1 CLONE
[10ug purified plasmid]
¥46,000
Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG01詳細データ GCP CCPCTR01-CG01-10 1 CLONE
[10ug purified plasmid]
¥46,000
Scrambled sgRNA control for pCRISPR-CG02詳細データ GCP CCPCTR01-CG02-10 1 CLONE
[10ug purified plasmid]
¥46,000
sgRNA Scrambled Control Lentiviral Particles詳細データ GCP LPPCCPCTR01L03-100 100 UL
[25 μl x 4 vial, 1×10^8 TU/ml]
¥167,000

 

野生型Cas9とニッカーゼ改変型Cas9

Cas9クローンは、ヒトコドンに最適化済みの野生型Cas9ヌクレアーゼ(化膿レンサ球菌)を発現します。ニッカーゼ改変型Cas9クローンは第10位のアミノ酸をアスパラギン酸からアラニンへと置換(D10A)させたCas9変異体を発現します。Cas9ヌクレアーゼは単鎖ガイドRNA(sgRNA)とともに、直後にN-G-Gプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)をもつ20塩基標的部位において部位特異的二本鎖切断(DSB)を産生します。DSB(DNA二本鎖切断)は、誤りを犯しがちでこれがフレームシフト変異につながる非相同性末端結合(NHEJ)、あるいは、修復テンプレート存在下では相同組換え(HR、HDR)により修復されます。CRISPR-Cas9技術は、DSB(DNA二本鎖切断)を高頻度で誘導することから、数々の実験システムにおいて遺伝子ノックアウトや、点変異、レポーターやその他の修正のノックインに利用されています。Cas9 D10Aニッカーゼは野生型Cas9と同様の認識システムを利用しますが、こちらは通常NHEJやHRにより修復されない一本鎖の「ニック」のみを生ずる点が異なります。2種のsgRNAが正しい方向性をもって、期待する部位に隣接する両鎖をそれぞれ標的した場合、DSB(DNA二本鎖切断)が生じてNHEJや相同組換え(HR、HDR)による効率のよい修復を受けることになります。

CRISPR-Cas9による遺伝子工学

図.2 CRISPR-Cas9による遺伝子工学
(左)sgRNAに先導されたCas9ヌクレアーゼにより生じたDSBのNHEJによる修復
(右)sgRNAに先導されたCas9ヌクレアーゼにより生じたDSBのHRによる修復とこれに伴うドナープラスミドからの期待する遺伝子または選択マーカー(他の遺伝要素など)の挿入

結合した側鎖に位置本鎖切断を生ずるCas9ニッカーゼの模式図

図.3 結合した側鎖に位置本鎖切断を生ずるCas9ニッカーゼの模式図

野生型Cas9クローン、レンチウイルス粒子

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
Cas9 nuclease expression clone (CMV, mCherry / Neomycin)詳細データ GCP CP-C9NU-01 1 CLONE
[10μg]
¥137,000
Cas9 nuclease lentiviral expression clone(CMV, Neomycin)詳細データ GCP CP-LVC9NU-01 1 CLONE
[10μg]
¥137,000
Cas9 nuclease lentiviral expression clone(CMV, eGFP/Neomycin)詳細データ GCP CP-LVC9NU-02 1 CLONE
[10μg]
¥137,000

ニッカーゼ改変型Cas9クローン

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
Cas9 D10A nickase expression clone詳細データ GCP CP-C9NI-01 1 CLONE
[10μg]
¥137,000
Cas9 D10A nickase expression clone詳細データ GCP CP-C9NI-02 1 CLONE
[10μg]
¥137,000

 

使用例

HUWE-sgRNA
HEK293T細胞を用いたHUWE I-sgRNA/Cas9によるHUWE I 遺伝子標的

図.4 HEK293T細胞を用いたHUWE I-sgRNA/Cas9によるHUWE I 遺伝子標的
(A) HUWE I-sgRNAとゲノムDNA PCRプライマーデザイン
(B) 6ウェルプレートを用いてHEK293T細胞にHUWE I-sgRNAクローン(レーン1)またはスクランブルsgRNA/Cas9コントロールクローン(レーン2)をトランスフェクションした。トランスフェクションから40時間後に細胞を回収した。ゲノムDNAを抽出後、HUWE特異的PCRプライマーを用いてPCR増幅した。PCR産物はゲル精製した。8uLの精製済みPCR産物をバッファーと混合後、変性と再アニーリングを行い、37℃で60分間T7エンドヌクレアーゼI(ENI)処理した。HUWE PCR産物サイズは520bpであり、予想されるT7 ENI処理産物サイズは330bpと190bpである。

複数遺伝子を標的としたCRISPR-Cas9マルチプレキシング

図.5 複数遺伝子を標的としたCRISPR-Cas9マルチプレキシング
HEK293T GFP安定発現細胞にCas9発現プラスミドとp53, HUWE1, NCL3およびGFPを標的とする複数のsgRNAs(レーン1~4)またはスクランブルsgRNA(レーン5~8)を同時にトランスフェクションした。ゲノムDNAを抽出し、複数の標的部位に挿入欠損が存在するかT7エンドヌクレアーゼI(ENI)アッセイを行って確認した。"*"はCas9と複数sgRNAsにより各標的部位に効率的に挿入欠損が導入されたことを示す(レーン1~4)。
PCR産物サイズとT7 ENI切断産物サイズ:GFP: 720bp (未処理), 340bp + 380bp (切断後); NCL3: 765bp (未処理), 295bp +470bp (切断後); HUWE: 520bp (未処理), 190bp + 330bp (切断後); P53: 825bp (未処理), 475bp + 350bp (切断後).

商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

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