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迅速かつ高感度にマイコプラズマを検出！ e-Myco™ VALiD-Q マイコプラズマ qPCR 検出キット (ver. 2.0)

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メーカー名：iNtRON Biotechnology, Inc

本製品は、培養細胞などの生物材料におけるマイコプラズマを検出するためのキットです。

背景

マイコプラズマは微小な原核生物であり、細胞培養における一般的なコンタミネーション源として知られています。マイコプラズマに汚染された細胞は、代謝や増殖の抑制を受け、タンパク質および遺伝子発現に変化が生じます。一般的に、マイコプラズマおよびアコレプラズマの20種以上が細胞培養での主要な汚染源とされており、その中でもM. arginine、M. fermentans、M. hyorhinis、M. orale、A. laidlawiiの5種が、5%～35%以上を占めています。
マイコプラズマの汚染経路としては、培地添加剤、作業環境、作業者、すでに汚染された細胞株からの交差汚染などが挙げられます。

e-Myco™ VALiD-Q マイコプラズマ qPCR 検出キット（ver. 2.0）は、マイコプラズマの16S rRNA遺伝子領域を標的とした特異的プライマーおよびプローブセットで構成されています。本商品は10 CFU/ml以上のマイコプラズマを検出する高感度なリアルタイムPCRキットであり、リアルタイムPCRの実行を検証するための内在性コントロール（インターナルコントロール）およびポジティブコントロールが含まれています。

特長

高感度・高特異性

特異的プライマーとプローブにより、マイコプラズマを検出
検出感度は10 CFU/mL

迅速な検出

リアルタイムPCRを用いて1時間以内に検出可能

内在性コントロール（IPC）の搭載

PCR反応の成功を確認するためのIPCを搭載

偽陰性のリスクを低減

構成内容

2X qPCR Mix : 280 µl　x 2 vials
Detection solution : 140 µl x 2 vials
Positive control (External PC) : 25 µl x 3 vials
DNase/RNase free water (NC) : 1 ml x 1 vial

ワークフロー

プロトコール

細胞からゲノムDNA抽出を抽出します。 iNtRON Biotechnology社では、G-spin™ Total DNA Extraction Kit（品番：17045）の使用を推奨しております。

Real-time PCRチュ-ブにDetection Mixを調製します。

構成品	サンプル	ポジティブコントロ-ル	ネガティブコントロ-ル
2X qPCR Mix	10 µl	10 µl	10 µl
Detection solution	5 µl	5 µl	5 µl
Sample	5 µl	-	-
Positive control	-	5µl	-
DNase/RNase Free water	-	-	5µl
（総量）	20µl	20µl	20µl

遠心後、リアルタイムPCRを行います。
反応条件

温度	時間	サイクル数
37℃	2 min	1
94℃	2 sec	1
94℃	5 sec	5
60℃	10 sec	5
94℃	5 sec	45
60℃^*1	10 sec	45

*1：下線は検出ステップです。

ターゲット	チャネル設定
マイコプラズマ	FAM
内在性コントロール（IPC）	HEX

データ解析

**予想されるリアルタイムPCRデータ**
ターゲット	ベースライン	閾値	ポジティブ	ネガティブ
マイコプラズマ	Auto	Auto^*2	≦45	＞45
内在性コントロール（IPC）	Auto	Auto^*2	22～27^*3

*2：閾値を手動設定する場合は、閾値ラインをグラフに引き、ポジティブコントロール反応における蛍光シグナルの飽和レベルの 5～10%に閾値を合わせます。
*3：IPCのCt 値が27を超える場合は、大量の標的 DNA との競合反応によると考えられますが、結果は正常です。

製品データ

図1. 検出限界の評価
e-Myco™ VALiD-Q マイコプラズマ qPCR 検出キット（ver. 2.0）の検出限界を評価するため、7種のマイコプラズマ属菌を直接培養して得られた培養液から核酸を抽出し、製品の検出限界を評価した。抽出したゲノムDNAを1x10,000 CFU/ml～1 CFU/mlに希釈し、5段階の濃度勾配で検出結果を確認した。その結果、全てのマイコプラズマゲノムDNAの検出限界は10 CFU/ml以下であった。

図2. 特異性の評価
e-Myco™ VALiD-Q マイコプラズマ qPCR 検出キット（ver. 2.0）の特異性を評価するため、 10 ng/µL の濃度のゲノム DNA を使用して、マイコプラズマ以外の細菌株( Clostridium(C. perfringens)、Lactobacillus(L. Sakai)、Streptococcus(S. salivarius)) から核酸を抽出し、検出した。結果は陰性であり、IPCの増幅も22～27と正常範囲内であった。

図3. 競合品との比較と検出性能の評価
e-Myco™ VALiD-Q マイコプラズマ qPCR 検出キット（ver. 2.0）は、競合他社のキットよりも最大で60分以上マイコプラズマ検出にかかる時間を短縮できた。また、10 CFU/mlのマイコプラズマの認定標準パネルを使用してすべて検出できることを確認した。