脱アセチル化活性を簡便に測定 FLUOR DE LYS® HDAC 活性アッセイキット（蛍光）

統括的な HDAC・Sirtuin 活性の測定、阻害剤・活性剤スクリーニングにご使用いただける蛍光アッセイキットです。

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  FLUOR DE LYS® HDAC アッセイ（蛍光）

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※ BML-AK503-0001 に含まれている HeLa 細胞核抽出物は、BML-KI140-0100 ではありません。単品販売していませんのでご注意ください。

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品名

FLUOR DE LYS® 細胞内 HDAC 蛍光活性アッセイキット（品番：BML-AK503-0001）

用途

1. 細胞内外の HDAC・Sirtuin 活性をトータルに測定
2. 細胞内外の HDAC・Sirtuin 活性を別々に測定
3. 添付のコントロール HeLa 核抽出物を使った阻害剤活性測定

プロトコール概略

細胞透過性の FLUOR DE LYS® 基質を培養細胞に加えてインキュベートし、その後、

1. を行う場合は、溶解バッファー、FLUOR DE LYS® ディベロッパーを加え、蛍光を測定します。
2. を行う場合は、細胞と培養液に分け、細胞の方に溶解バッファーを加え、細胞と培養液それぞれを FLUOR DE LYS® ディベロッパーで処理し、蛍光を測定します。
3. を行う場合は、培養細胞は使用せず、HDAC 活性コントロールとしてキットに添付されている HeLa 核抽出物に FLUOR DE LYS® 基質を加えたもの、さらにご希望の阻害剤を加えたものを用意し、それぞれを FLUOR DE LYS® ディベロッパーで処理し、蛍光を測定します。

サンプル

• 培養細胞
• HDAC 阻害活性を有する化合物

製品データ

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図1 HeLa 細胞での FLUOR DE LYS® 基質脱アセチル化のタイムコース
1ウェルあたり HeLA 4x10⁴ 細胞を撒き、80% コンフルエンスになるまで培養する。それから細胞に、200 µM FLUOR DE LYS® 脱アセチル化酵素基質、+/- 1 µM トリコスタチンA を加えた反応系でインキュベートした。蛍光はプロトコール例1（AFU=Arbitary Fluorescence units, CytoFluor™ II, PerSeptive Biosystems, Ex. 360 nm, Em. 460 nm, gain=70）に記述されている通りに決定した。各ポイントは3回試験した平均を示し、エラーバーは +/- 標準偏差を示している。

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図2 細胞密度の違いによる FLUOR DE LYS® 基質脱アセチル化活性の違い
1ウェルあたり HeLa 細胞を 0.5x10⁴ 細胞（30% コンフルエンス）、2x10⁴ 細胞（80% コンフルエンス）を撒き、表で示されたコンフルエンスになるまで2日間培養した。それから細胞に、200 µM FLUOR DE LYS® 脱アセチル化酵素基質、+/- 1 µM トリコスタチンA を加えた反応系でインキュベートした。蛍光はプロトコール例1 （AFU=Arbitary Fluorescence units, CytoFluor™ II, PerSeptive Biosystems, Ex. 360 nm, Em. 460 nm, gain=70）に記述されている通りに決定した。各ポイントは3回試験した平均を示し、エラーバーは +/- 標準偏差を示している。

品名

FLUOR DE LYS® HDAC 蛍光活性アッセイキット（品番：BML-AK500-0001）
FLUOR DE LYS® Green HDAC 蛍光活性アッセイキット（品番：BML-AK530-0001）

FLUOR DE LYS® と FLUOR DE LYS® GREEN の違いは？

励起波長と蛍光波長が異なります。FLUOR DE LYS® は 360/460 nm ですが、FLUOR DE LYS® GREEN は、より高波長 485/530 nm なため、消光やUV、青色領域に近い吸収をもつ化合物による蛍光干渉を防ぎます。

用途

1. 組織・細胞抽出物／免疫沈降物／精製酵素の HDAC・Sirtuin 活性をトータルに測定
2. 様々な条件下での HDAC・Sirtuin のカイネティクス解析
3. 添付のコントロール HeLa 核抽出物を使った阻害剤活性測定

プロトコール概略

1. を行う場合は、FLUOR DE LYS® 基質をサンプルに加えてインキュベートし、その後、FLUOR DE LYS® ディベロッパーを加え、蛍光を測定します。
2. を行う場合は、濃度をいくつかに分けた FLUOR DE LYS® 基質をサンプルに加えてインキュベートし、その後、FLUOR DE LYS® ディベロッパーを加え、蛍光を測定します。
3. を行う場合は、HDAC 活性コントロールとしてキットに添付されている HeLa 核抽出物に FLUOR DE LYS® 基質を加えたもの、さらにご希望の阻害剤を加えたものをそれぞれ用意し、FLUOR DE LYS® ディベロッパーで処理し、蛍光を測定します。

サンプル

• 組織・細胞抽出物／免疫沈降物／精製酵素
• HDAC 阻害活性を有する化合物

製品データ

図3 HeLa 細胞での FLUOR DE LYS® 基質脱アセチル化のカイネティクス
HeLa 核抽出物（0.5 µL/well）を、116 µM 基質と表で示されたトリコスタチンA濃度と一緒にインキュベート（25℃）した。反応は10分後に FLUOR DE LYS® Developer を加えて停止し、蛍光を測定した（CytoFluor™ II, PerSeptive Biosystems, Ex. 360 nm, Em. 460 nm, gain=85）。

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図4 免疫沈降物 HDAC1、2、3 による FLUOR DE LYS® 基質の脱アセチル化
Seize™ X Protein A 免疫沈降キット（Pierce社）を使って HeLa 核抽出物から免疫沈降によって各 HDAC が採取された。10 µg 各抗 HDAC 抗体 または 10 µL コントロール血清が使用された（全てウサギポリクローナル抗体; 抗HDAC1-3　品番:BML-SA401、BML-SA402、BML-SA403）。HDAC／抗 HDAC 抗体複合体が結合したビーズを 150 µL の 100 µM FLUOR DE LYS® 基質と一緒に、表に示された時間、振盪させながらインキュベート（25℃）した。30 µL ずつ回収し、20 µL アッセイバッファー、50 µL FLUOR DE LYS® Developer と混合し、蛍光を測定した（CytoFluor™ II, PerSeptive Biosystems, Ex. 360 nm, Em. 460 nm, gain=85）。

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図5 HeLa 核抽出物による FLUOR DE LYS® 基質の脱アセチル化活性のトリコスタチンA（阻害剤）阻害
HeLa 核抽出物（0.5 µL/well）を 116 µM 基質と表で示されたトリコスタチンA濃度と一緒にインキュベート（25℃）した。反応は10分後に FLUOR DE LYS® Developer を加えて停止し、蛍光を測定した （CytoFluor™ II, PerSeptive Biosystems, Ex. 360 nm, Em. 460 nm, gain=85）。

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