蛍光分析による生細胞のモニターに 生細胞染色試薬　蛍光性エステラーゼ基質

カルセインAMは、生細胞の細胞生存率を測定するために一般的に使用されている疎水性化合物です。 カルセインへのAMエステルの結合は、損傷のない細胞膜への透過を促進し、色素がエステラーゼ触媒加水分解によって細胞内で活性化されると蛍光シグナルを生成します。このエステラーゼ活性は生細胞数に比例するため、カルセイン産物の蛍光強度と正比例します。

カルセインは495nmと515nmにおいて最大励起と最大発光を示し、GFPやFITCと同様のスペクトル特性をもつため、GFPやFITCとの多色分析にはほとんど使えません。
この限界に立ち向かうため、AAT Bioquest（ABD）社では、様々な蛍光発光をもつ包括的なカルセイン類似体を開発しました（図3）。例えば、Calcein UltraBlue™ AM (Ex/Em = 360/445 nm) を細胞非透過性Nuclear Green™ DCS1 (Ex/Em = 503/526 nm) といった緑色蛍光指示薬と組み合わせて用いることで、細胞生存率や細胞毒性の多色評価を行うことができます。

CytoCalcein™ Violet 450 と CytoCalcein™ Violet 500プローブは、フローサイトメーターに一般的に装備されている405nmの紫ダイオードレーザーで効率よく励起するよう最適化されています。加水分解され励起するとCytoCalcein™ Violet 450は青色蛍光を産生し、CytoCalcein™ Violet 500は緑色蛍光を産生します。

フルオレセイン二酢酸（Fluorescein Diacetate:FDA）は、細胞生存率評価に使用できる細胞透過性かつ非蛍光フルオレセイン誘導体です。細胞内に入ると、エステラーゼが二酢酸基を加水分解してフルオレセインが産生します。488nmアルゴンレーザーで励起されると、FDAは緑色蛍光を発します。FDAは、細胞生存率の決定にヨウ化プロピジウム（PI）と組み合わせて使うことができます。非生存細胞と生存細胞をこの2色で分離することで、単色分析に比べて細胞生存率をより正確に定量できます。フルオレセインは光退色の割合が高く細胞保持がよくないため、代替品としてカルボキシフルオレセイン二酢酸やCytoTrace™色素の使用をお奨めします。

カルボキシフルオレセイン二酢酸（CFDA）はスペクトル的にFDAと同一であり、蛍光性細胞生存率指示薬として使用できます。細胞内エステラーゼによりCFDAが加水分解されると、カルボキシフルオレセインが産生し、488nmアルゴンレーザーで励起されると緑色蛍光を発します。フルオレセインに比べ、カルボキシフルオレセインにはより多くの負電荷が含まれるため細胞内保持が改善されています。

ATT Bioquest (ABD) 社のCytoTrace™ 色素は、細胞生存率評価用の細胞透過性チオール反応性蛍光指示薬です。さらに、長期にわたる細胞増殖トレーサーとしても機能します。CytoTrace™ 色素は、細胞集団内の近接細胞に転移することなく多くの生細胞において複数世代を超えて良好に保持されます。蛍光顕微鏡やフローサイトメトリーを用いてモニターできます。
CytoTrace™ Green CMFDA と CytoTrace™ Red CFDAは、細胞膜を自由に透過でき、細胞成分と反応すると細胞不透過性産物に変換されます。これらの指示薬を導入した細胞は、通常少なくとも24時間にわたり蛍光を発し生存します。染色パターンはシグナル増幅や他の下流アプリケーションに向けてホルムアルデヒドやグルタルアルデヒドで固定できます。
CytoTrace™ Orange CMTMR と CytoTrace™ Red CMTPXは、細胞透過性かつ蛍光度の高いローダミン色素であり、その蛍光活性化にエステラーゼ切断を必要としません。これらの指示薬を導入した細胞は、通常少なくとも72時間にわたり蛍光を発し生存します。これらの色素は希釈濃度において安定かつ無毒であり、生理学的pHにおいて明るい蛍光を発します。CytoTrace™ CMTMR とCMTPX色素の励起と発光スペクトルは、GFPと良好に分離できるため、マルチプレックス分析に適しています。
CytoTrace™ 色素を、PIやABD社のNuclear DCS1色素といった膜非透過性核酸染色試薬とともに使用すると比較的長期にわたり細胞生存率と細胞障害性の定量を行うことができます。