細胞酵素活性応答性色素を用いた細胞生存率/細胞毒性アッセイ用に 細胞染色用 酸化 / 還元プローブ

レサズリンは水溶性かつ酸化還元感受性の試薬であり、様々な細胞障害性や増殖アッセイにおいて細胞生存率の蛍光指示薬として広範に使用されています。レサズリンからレゾルフィンへの還元と、細胞集団における生細胞数とは相関関係にあります。この特徴は、細胞生存率、細胞障害性、および増殖を評価する上で広範に使用されています。570nmと600nmにおける吸光度比の測定や、Cy3/TRITCフィルターセット (Ex/Em= 571/585 nm)を用いた蛍光測定により、還元レベルが定量できます。産生された比色定量的または蛍光定量的シグナルはサンプル中の生細胞数に比例します。レサズリンは、細胞培養中のどの段階でも添加することができ、無毒なため細胞を無傷に保つことができることから、平行分析を行うこともできます。レサズリンを用いて細胞増殖を測定する場合、細胞が対数増殖期にあるときにレサズリンを添加することをお奨めします。

フルオレセインとローダミン色素は、無色かつ非蛍光の“ジヒドロ”色素へと化学的に還元させることができます。活性酸素種による酸化によりジヒドロ色素が元の色素に戻り、その蛍光特性が回復します。活性酸素種の産生は生細胞の特徴であり、死細胞では生じないことから、この蛍光発生的な酸化プローブは細胞の生存率評価に利用できます。

• ジヒドロフルオレセイン二酢酸と2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセイン二酢酸（DCFH-DA）はいずれも、蛍光特性の回復に細胞内エステラーゼによる加水分解と酸化が必要です。ジヒドロフルオレセイン二酢酸とDCFH-DAは何れも488nmアルゴンレーザーで励起されると緑色蛍光を発生します。
• ジヒドロローダミン123（DHR 123）は酸化されて直接ミトコンドリア染色のローダミン123となり、488nmアルゴンレーザーで励起され緑色蛍光を発生します。

テトラゾリウム塩は、細胞の酸化還元電位を検出し細胞生存率や細胞障害性を評価するために使われます。ReadiUse™ WST-8（2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, 一ナトリウム塩）は、細胞代謝活性の測定に使用される水溶性テトラゾリウム塩です。細胞非透過性のWST-8は、主に細胞表面で生ずる一連の複雑な細胞機序により（中性pHにおいて）、細胞外で水溶性の橙色ホルマザン色素に還元されます。この生体内還元性は、生細胞における解糖系NADPH産生によるものです。還元レベルは、460nmにおける吸光度を測定することで定量できます。ホルマザン色素量の産生量は、サンプル中の生細胞数に正比例します。WST-8は非常に安定であり、細胞毒性が低いことから長期にわたる培養（24 - 48時間）に適しています。

図2. 50 mM水溶液におけるReadiUse™ WST-8の化学構造