ミトコンドリア機能研究のための選択的プローブのご紹介

ミトコンドリアは酸化的リン酸化と脂質酸化を介して細胞エネルギーを生産していることが知られています。細胞のエネルギー生産所としての役割に加え、ミトコンドリアは他の重要な細胞の生理学的および病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たします。 たとえば、ミトコンドリアは、アポトーシスの固有の経路を調節する役割を果たします。また、細胞質カルシウムの緩衝と形成にも寄与し、スーパーオキシド (・-O₂^-) などの細胞活性酸素種 (ROS) の生産者でもあります。さらに、ミトコンドリアの機能不全は、神経変性疾患や心血管疾患、慢性疲労など、多くの慢性疾患につながります。

AAT Bioquest社では、ミトコンドリアの形態と機能、および ROS イメージングを調査するために設計された幅広いツールを提供しています。本ページでは、ミトコンドリア ROS イメージング用に最適化されたアッセイ試薬とキットに焦点を当て、ミトコンドリアカルシウムの検出における Rhod-2 感度を向上させる便利な方法を探ります。ミトコンドリアの形態と機能をモニターするために提供するさまざまなツールの詳細な概要については、ページ下部の関連商品リストをご参照ください。

ROSはミトコンドリアの酸化的リン酸化の副産物です。これらの化学的に反応性の高い酸素含有種は、酸化還元シグナルを促進するために細胞質内に放出されます。しかし、活性酸素の生成-解毒のバランスが崩れると、酸化ストレス (ROS の過剰生成) につながります。活性酸素の過剰生成はミトコンドリアにとって有害なため、正常な細胞恒常性を維持するために中和する必要があります。中和が行われないと、ミトコンドリアの脂質、タンパク質、DNAに損傷を与え、ミトコンドリア膜透過性遷移孔（mPTP）の誘導などの細胞傷害を与える活動を誘発する可能性があります。mPTPチャネルの開口は、内膜透過性の上昇、ミトコンドリア膜電位の散逸、ATP産生量の減少をともないます。そしてmPTPの開口によって引き起こされる変化は、細胞死を誘発する可能性があります。

そのため、ミトコンドリア活性酸素は、虚血再灌流障害、心筋梗塞、慢性疾患（神経変性疾患、2型糖尿病など）など、さまざまな病態に関与していることが知られています。このように、ミトコンドリア活性酸素の検出と定量は、細胞の適切な酸化還元の調節と、その調節不全が様々な細胞内経路や病態に及ぼす影響を理解する上で重要です。

スーパーオキシドラジカル

ミトコンドリアは、ミトコンドリア呼吸の副産物として細胞スーパーオキシド (・-O₂^-) を産生します (最も顕著なのはComplex I およびComplex III による産生)。スーパーオキシドは、ミトコンドリアにおける主要な ROS です。スーパーオキシドは、低から中程度のレベルであれば、遺伝子発現やシグナル伝達を含む多くの必須細胞プロセスの適切な制御に不可欠です。しかし、ミトコンドリアのスーパーオキシドジスムターゼ（スーパーオキシドラジカルを中和する酵素）を欠損したマウスは、神経変性、心筋症、乳酸アシドーシス（スーパーオキシド濃度の上昇と相関する疾患）により死亡すると報告されています（Muller et al.　2007）。したがって、ミトコンドリアのスーパーオキシドレベル（外因性または内因性）を調べることは、これらのミトコンドリア関連疾患を研究する上で非常に重要です。

Cell Meter™ Fluorimetric Mitochondrial Superoxide Activity Assay Kit

図1．
さまざまな活性酸素種 (ROS) および活性窒素種 (RNS) に対するMitoROS™ 580 (10 µM、品番： 16052)の蛍光応答。蛍光強度はEx/Em = 540/590 nmでモニタリングしている。

MitoROS™ 580 は、ジヒドロエチジウム (一般的なスーパーオキシド指示薬) や市販の競合他社品(T社品)と同様の特性を持ちます。したがって、ジヒドロエチジウムまたは 競合他社品(T社品)を利用した実験は、アッセイ感度を落とすことなくMitoROS™ 580 に切り替えができます。実際、MitoROS™ 580 は他の活性酸素種や活性窒素種によって酸化される可能性が低くなります (図1)。MitoROS™ 520 および MitoROS™ 580 は 2 つのユニークなスーパーオキシド指示薬であり、AAT Bioquest社の Cell Meter™ 蛍光測定ミトコンドリア スーパーオキシド活性アッセイのメイン構成品です。両方のプローブのカチオン特性は、細胞質膜とミトコンドリア膜を横切る拡散を促進するだけでなく、ミトコンドリア膜電位を介してミトコンドリア内での潜在的な取り込みを促進します。他の市販の -O₂^- 指示薬と同様に、MitoROS™ 520 および MitoROS™ 580 プローブは、スーパーオキシドによる酸化によって活性化されます。活性化された MitoROS™ 520 および MitoROS™ 580 プローブは、強力な蛍光シグナルの生成に不可欠な DNA に挿入されます。励起すると、MitoROS™ 520 は緑色の蛍光を発し、MitoROS™ 580 は赤色の蛍光を発します。

MitoROS™ 520 は、スーパーオキシドによって酸化されて DNA に結合すると、強い緑色の蛍光を発するという点でユニークです (図2)。緑色スペクトルを利用することで、MitoROS™ OH 580 (ヒドロキシルラジカル指示薬) などの他の赤色 ROS 指示薬から十分なスペクトル分離が作成され、スーパーオキシドとヒドロキシルラジカルレベルの同時モニタリングに適しています。または、MitoROS™ 520 と赤色カルシウム指示薬である Rhod-2 を使用して、ミトコンドリアのカルシウム取り込みと ROS 産生を調べることができます。

図2. Cell Meter™ Fluorimetric Mitochondrial Superoxide Activity Assay Kit (品番：16060) を使用したマクロファージのスーパーオキシド測定の蛍光画像
RAW 264.7 細胞を 100,000 cell/well/100 µL で、96 ウェル黒色/透明底プレートに一晩播種した。
AMA treatment : 細胞を 5 µM Antimycin A (AMA) で 37 ℃ で 2 時間処理し、その後 MitoROS™ 520 とともに 1 時間インキュベートした。
Untreated Control : RAW 264.7 細胞を、AMA 処理なしで MitoROS™ 520 とともに 37℃で 1 時間インキュベートした。蛍光シグナルは、FITC フィルターを備えた蛍光顕微鏡を用いて測定した。

ヒドロキシルラジカル

ヒドロキシルラジカル (・-OH) は、酸化的代謝の別の副産物であり、最も反応性の高い ROS です。ヒドロキシル ラジカルは、DNA 損傷を引き起こし、オルガネラに重大な細胞内損傷を引き起こす可能性があります。したがって、細胞内の・-OHの高感度かつ選択的な検出は、細胞の酸化還元と、細胞内の調節不全に対するヒドロキシルラジカルの影響を理解するために不可欠です。さまざまな ・-OH 蛍光発生センサーが販売されていますが、その多くは急速な光退色、短い発光波長、および他の ROS 種との非選択的反応に悩まされています。これらすべての要因により、細胞および組織への適用が制限されています。これらの制限を解決するために、AAT Bioquest社 は、堅牢で感度の高い ・-OH 蛍光発生センサーである MitoROS™ OH580 の製造において、広範な研究開発に専念してきました。

Cell Meter™ Mitochondrial Hydroxyl Radical Detection Kit

図3．Cell Meter™ Mitochondriol Hydroxyl Radical Detection Kit (品番：16055)を使用したHeLa 細胞のヒドロキシルラジカル測定の蛍光画像
コントロール (図3上) : HeLa 細胞を処理せずに 1X HBSS バッファー中に保存しました。細胞核をHoechst 33342 (Blue、品番：17530)で染色した。Fenton反応 (図3下) : 細胞を 1X HBSS 緩衝液中の 10 µM CuCl₂ および 100 µM H₂O₂ で 37℃ で 1 時間処理した。HHBS で 3 回洗浄後、TRITC フィルターセット (赤色) を備えた蛍光顕微鏡を使用して HeLa 細胞を測定しました。

Cell Meter™ ミトコンドリア ヒドロキシル ラジカル検出キット (品番：16055)のメイン構成品のMitoROS™ OH580 は、細胞透過性の蛍光指示薬で、スーパーオキシドや過酸化水素などの他の ROS よりもヒドロキシル ラジカルに対して高度に選択的です。MitoROS™ OH580 と ・-OH との特異的相互作用により、非特異的なバックグラウンド蛍光が最小限に抑えられ、細胞内 ・-OH シグナルが大幅に強化されます。・-OH と結合すると、MitoROS™ OH580 は強い赤色蛍光を示します。この蛍光シグナルは、蛍光顕微鏡でモニターすることも、蛍光マイクロプレートリーダーを使用して Ex/Em = 540/590 nm で測定することもできます。MitoROS™ OH580 の赤色スペクトルの利用により、緑色蛍光のミトコンドリア形態学的プローブとの多重化が可能になります。

ミトコンドリアにおけるカルシウムの取り込みと排出は、細胞質カルシウム濃度や代謝プロセスを制御する上で重要です。ミトコンドリアは、主にミトコンドリア内膜にあるミトコンドリアカルシウムユニポーター（MCU）を介して、カルシウムを急速に取り込む能力を有します。ミトコンドリアマトリックスへのカルシウムの流入は、細胞内のカルシウムの電気化学的勾配に依存して起こります。この勾配はミトコンドリア呼吸によって形成・維持され、ミトコンドリアのナトリウム-カルシウムアンチポーターは、ミトコンドリア内のカルシウム濃度を低い静止状態に維持する役割を担っています。

ミトコンドリア内カルシウムは、クエン酸サイクル（CAC）の3つの主要な速度制限脱水素酵素を標的とすることで、ミトコンドリア代謝の調節に密接な役割を果たします。カルシウムは酵素複合体に直接結合し、α-ケトグルタル酸脱水素酵素とイソクエン酸脱水素酵素を活性化します。ピルビン酸脱水素酵素については、カルシウムに依存した脱リン酸化のステップを介して活性化します。ミトコンドリアにおけるこれらの脱水素酵素のカルシウムによる活性化は、NADHの増加とATPの産生をもたらします。ミトコンドリアのカルシウム取り込みが阻害されると、細胞質カルシウムシグナルの時空間特性が変化し、ミトコンドリアの代謝が抑制され、ATPの産生が低下します。このようなミトコンドリアカルシウムの取り込みの乱れは、慢性疲労などの疾患を引き起こすことが報告されています。

Rhod-2:ミトコンドリアカルシウム指示薬

図4．Rhod-2 AM *UltraPure Grade* CAS RN: 145037-81-6 (品番：21062)の化学構造

Rhod-2, AMはローダミン・ベースのカルシウム指示薬で、細胞内のミトコンドリアカルシウムの変化を測定するために使用できます。 Rhod-2, AMはAMエステルと共役してカチオン化されています。これにより2つのメリットが存在します。

1. Rhod-2,AM 上のカチオン電荷は、ミトコンドリア膜電位を介してミトコンドリア内での Rhod-2 の電位駆動蓄積を促進します。
2. AM エステルは細胞質膜を横切る Rhod-2 の拡散も促進します。ミトコンドリア膜のようなものです。ミトコンドリアに入ると、非特異的な細胞内エステラーゼによって AM基が除去され、Rhod-2 がミトコンドリア内に閉じ込められます。Rhod-2 は、カルシウムイオンと会合すると蛍光強度の顕著な増加を示します。

Rhod-2 は、それぞれ 549 nm と 578 nm に蛍光励起と発光の最大値を持ちます。この特徴的な長波長により、比較的高い自家蛍光を持つ細胞および組織のイメージングに適しています。これは、光受容体や光活性化型のキレート剤によって生成されるカルシウム放出を検出するのに有利です。

一方、Rhod-2 AMの欠点は、バックグラウンドの干渉を受けやすいことです。エステラーゼは細胞質全体に存在しており、ミトコンドリア特異的ではありません。Rhod-2 AMが細胞内に入り込むと、ミトコンドリア内に取り込まれる前に細胞質で指示薬が活性化され、細胞質内に保持されてしまう可能性があります。Rhod-2の感度を向上させる解決策は、使用前にDihydrorhod-2 AMに還元することです。

Rhod-2 感度の向上 : Rhod-2の還元

Rhod-2 AM をジヒドロRhod-2 AM に還元すると、ミトコンドリア局在が強化され、バックグラウンドの干渉が減少します。この変化により、活性化までのプロセスが２段階必要となるため、感度が向上します。非蛍光性のジヒドロRhod-2 AM は、ミトコンドリア内で酸化および AM が切断された後にのみ、カルシウム依存性の蛍光を示します。AM 切断により細胞質内に残った残留ジヒドロRhod-2は、ミトコンドリアに取り込まれて酸化されることができず、細胞質カルシウムの存在下でも非蛍光のまま残ります。Rhod-2 AM からジヒドロRhod-2 AM への還元は、以下のプロトコールを使用して容易に実行できます。

1. 50 µg の Rhod-2 AM を 100 µL の無水ジメチルスルホキシド (DMSO) に溶解する。
2. 固体の水素化ホウ素ナトリウム (NaBH4) を少し過剰に加える (実際に入れられる最小量の固体で十分です)。
3. 10 分間、または反応混合物が無色になるまでインキュベートする。
4. 通常の AM エステル導入プロトコルに従って、DMSO 中の反応溶液 (約 0.4 mM ジヒドロRhod-2 AM) を細胞ローディングに直接使用する。

*注意: ジヒドロRhod-2 AM は自然かつ急速に酸化型に戻ります。酸化型に戻ると、ストック溶液の色が再び呈色します。したがって、ジヒドロRhod-2 AM を使用する際は、調製後すぐに実験する必要があります。

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