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研究用

翻訳後修飾の解析にSignal-Seeker™ リン酸化チロシン濃縮キット

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Signal-Seeker™ リン酸化チロシン(ホスホチロシン)濃縮キットは、アフィニティービーズを用いて、細胞/組織ライセートからチロシンリン酸化されたタンパク質を免疫沈降により濃縮できるキットです。

チロシンリン酸化タンパク質を濃縮した後、目的のタンパク質を認識する一次抗体を用いて、ウェスタンブロットにより解析します(ウェスタンブロットに使用する抗体はキットに含まれません)。

使用目的

  • 一過性の調節メカニズムの研究
  • シグナル伝達経路に関わる複数のタンパク質の測定
  • 目的タンパク質の新しい修飾の発見
  • 調節メカニズムの解析
  • シグナル伝達に関わる、内在性 または 一過性に発現するタンパク質の測定

構成内容

Signal-Seeker™ リン酸化チロシン濃縮キット

キットには30反応分の試薬が含まれています。

  • BLASTR™ 溶解バッファー
  • BLASTR™ 希釈バッファー
  • BLASTR™ 洗浄バッファー
  • チロシンホスファターゼ阻害剤
  • プロテアーゼ阻害剤カクテル
  • リン酸化チロシンアフィニティービーズ
  • コントロールビーズ(非特異的結合の解析用・マウス IgG を共有結合したアガロースビーズ)
  • HRP標識 抗リン酸化チロシン抗体
  • Precision Red™ Advanced Protein Assay 試薬
  • ビーズ溶出バッファー
  • DMSO
  • 化学発光検出試薬A
  • 化学発光検出試薬B
  • スピンカラム
  • スピンカラムコレクションチューブ
  • BLASTR™ フィルター

その他 必要な試薬・機器

  • 目的の培養細胞/組織
  • PBS, pH 7.4(10 mM phosphate buffer pH 7.4, 140 mM NaCl, 3 mM KCl)
  • セルスクレーパー
  • 液体窒素(細胞ライセートの凍結用)
  • SDS-PAGE 用電気泳動装置・バッファー
  • ウェスタンブロット用転写装置・バッファー
  • 目的のタンパク質を認識する一次抗体
  • HRP標識 二次抗体
  • 2-メルカプトエタノール
  • 化学発光測定装置
 

アッセイ原理

アッセイフロー
(画像はクリックで拡大されます)

図1 アッセイフロー

使用例

チロシンリン酸化を受けた内在性の IkBα、RhoGAP、RasGAP の検出
(画像はクリックで拡大されます)

図2 チロシンリン酸化を受けた内在性の IkBα、RhoGAP、RasGAP の検出
HeLa 細胞を、100uM H2O2 で活性化したオルトバナジン酸ナトリウムで30分間処理(または未処理)した。NIH3T3 細胞を、100uM H2O2 で活性化したオルトバナジン酸ナトリウムで10分間処理(または未処理)した。マニュアルに従い、細胞を処理して解析した。各レーンは、ライセート 1 mg を用いた結果を示す。一次抗体として抗 IkBα抗体(1:1000、BD Biosciences社 品番 610690)、抗 RhoGap 抗体(1:1000、Millipore社 品番 05-378)、抗 RasGap 抗体(1:1000、BD Biosciences社 品番 610040)、二次抗体としてヤギ抗マウス抗体(1:20000、Jackson Labs社 品番 115-035-068)を用いて、ウェスタンブロットを行った。
この結果から、本キットを使用して、チロシンリン酸化を受けた内在性の IkBα(〜 38kDa)、RhoGAP(〜190kDa)、RasGAP(〜120kDa)を免疫沈降し、検出できることが示された。

 

Rac1 のチロシンリン酸化 および 活性化の経時変化
(画像はクリックで拡大されます)

図3 Rac1 のチロシンリン酸化 および 活性化の経時変化
本キットを用いて、上皮増殖因子(EGF)の刺激に応答した Rac1 のチロシンリン酸化を解析した。HeLa 細胞を24時間血清飢餓状態にし、EGF(50ng/mL)処理(または未処理)した(時間は図に示す)。図3Aは、本キットを使用し、抗 Rac1 抗体で検出した結果を示す。チロシンリン酸化された Rac1 の量は、EGFで刺激した最初の1分間、一貫して低下していた(実験は5回繰り返した)。興味深いことに、Rac1 の活性は、Rac1 のチロシンリン酸化の減少に伴い増加した(図3B)。この結果は、以前提案された、Ras GTPase 活性がキナーゼにより調節されるというモデルを支持する(5)。図3Cは、EGF刺激に応答した総リン酸化チロシンの量を、図3Dは、免疫沈降および活性化反応に使用したものと同量のライセートを示す(各ライセート 10 µL を電気泳動し、抗チューブリン抗体(T)、抗 Rac1 抗体(R)を用いてウェスタンブロットにより解析した)。矢印: 3% input。

参考文献

  1. Wang, Y, et al. 2015. Sequential posttranslational modifications regulate PKC degradation. Mol. Biol. Cell. 27: 410-420.
  2. Guo, Z, et al. 2012. Sequential posttranslational modifications program FEN1 degradation during cell cycle progression. Mol. Cell. 47: 444-456.
  3. Luo H-B, et al. 2014. SUMOylation at K340 inhibits Tau degradation through deregulating its phosphorylation and ubiquitination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111: 16586-16591.
  4. Satija Y.K. & Das S. 2016. Tyr99 phosphorylation determines the regulatory milieu of tumor suppressor p73. Oncogene 35: 513-5
  5. Bunda S. et al. 2014. Src promotes GTPase activity of Ras via tyrosine 32 phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA E3785-E3794.

Signal-Seeker™ リン酸化チロシン濃縮キット

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
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商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

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