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記事ID : 33041
研究用

翻訳後修飾の解析にSignal-Seeker™ アセチル化リジン検出キット

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Signal-Seeker™ アセチル化リジン検出キットは、アフィニティビーズを用いて細胞/組織ライセートからアセチル化修飾されたタンパク質を免疫沈降により単離・濃縮できるキットです。濃縮されたタンパク質は、標的タンパク質特異的な抗体を用いてウェスタンブロットにより解析します(ウェスタンブロットに使用する二次抗体はキットに含まれていません)。

使用目的

  • 一過性の調節メカニズムの研究
  • シグナル伝達経路に関わる複数のタンパク質の測定
  • 目的タンパク質の新しい修飾の発見
  • 調節メカニズムの解析
  • シグナル伝達に関わる、内在性 または 一過性に発現するタンパク質の測定

構成内容

キットには30反応分の試薬が含まれています。

細胞溶解とタンパク質濃度測定 免疫沈降とプレクリア 洗浄 溶出 ウェスタンブロット
BlastR™ 溶解バッファー アセチル化リジン
アフィニティビーズ 1
BlastR™ 洗浄
バッファー
スピンカラム 化学発光検出試薬A
BlastR™ 希釈バッファー IP用コントロール
ビーズ
コレクション
チューブ
化学発光検出試薬B
BlastR™ フィルター ビーズ溶出
バッファー
HRP標識抗アセチル化
リジン抗体(AAC03)
プロテアーゼ阻害剤カクテル
Trichostain A (Class I
およびII HDAC阻害剤)
Nicotinamide (Class III
HDAC阻害剤)
Precision Red™ Protein Assay試薬
DMSO

その他 必要な試薬・機器

  • 目的の培養細胞/組織
  • PBS, pH 7.4(10 mM phosphate buffer pH 7.4, 140 mM NaCl, 3 mM KCl)
  • セルスクレーパー
  • 液体窒素(細胞ライセートの凍結用)
  • SDS-PAGE 用電気泳動装置・バッファー
  • ウェスタンブロット用転写装置・バッファー
  • 目的のタンパク質を認識する一次抗体
  • HRP標識 二次抗体
  • 2-メルカプトエタノール
  • 化学発光測定装置

アッセイ原理

Signal-Seeker™ アセチル化リジン検出キットアッセイフロー

図1. アッセイフロー

製品データ

免疫沈降に用いるアフィニティビーズ(AAC04)には、アセチル化リジンを特異的に認識する抗体として、Cytoskeleton社が独自に開発したマウスモノクローナル抗体AAC02(Clone: 7B5A1)とAAC03(Clone: 19C4B2.1)の2種類が結合しています。

抗アセチル化リジン抗体を用いた免疫蛍光染色

図2. 抗アセチル化リジン抗体を用いた免疫蛍光染色
TSA(1 µM)で6時間処理したSwiss 3T3細胞の微小管およびミトコンドリアを、AAC02抗体およびAAC03抗体を用いて免疫蛍光染色で解析した。TSA処理により、アセチル化した微小管ネットワークおよびミトコンドリアが明確に観察され、AAC02/AAC03抗体がアセチル化リジン修飾に対する非常に強力で有用なツールであることが示された。
微小管:アセチル化リジン(緑)、アクチン繊維(赤)、核(青)
ミトコンドリア:アセチル化リジン(緑)、ミトコンドリア(橙)、アクチン繊維(紫)、核(青)

AAC04によるアセチル化リジンタンパク質の免疫沈降

図3. AAC04によるアセチル化リジンタンパク質の免疫沈降
Cos-7細胞から、本商品のアフィニティビーズ(AAC04)を用いてアセチル化リジンを免疫沈降(IP)し、他社競合品と比較した。Cos-7細胞は、nicotinamide(1 mM)およびTSA(1 µM)+/-の条件下で6時間処理した。
IPは、以下の条件で行っている。(1)AAC04を16.7 µL(20 µg抗体量)、(2)AAC04を50 µL(60 µg抗体量)、(3)他社競合品A: ラビット抗アセチル化リジンモノクローナル抗体ミックス(1/100希釈)、(4)他社競合品B: アセチル化リジンビーズ(40 µg抗体量)、(5)他社競合品B: アセチル化リジンビーズ(80 µg抗体量)、(6)マウスIgGコントロールビーズ(60 µg抗体量)
回収されたタンパク質のアセチル化タンパク質含有量は、HRP標識AAC03抗体(1:3,000)を用いてウェスタンブロットで解析した。結果として、他社競合品のアセチル化リジン濃縮試薬が豊富なアセチル化タンパク質(アセチル化チューブリンやヒストン)を主に濃縮したのに対して、AAC04は幅広い範囲のアセチル化タンパク質を濃縮した。

Signal-Seeker™ アセチル化リジン検出キット

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
Signal-SeekerTM Acetyl-Lysine Enrichment Kit詳細データ CYT BK163 30 ASSAY
¥139,000
Signal-SeekerTM Acetyl-Lysine Enrichment Kit詳細データ CYT BK163-S 10 ASSAY
¥48,000

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商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

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