FAQ : Alomone Labs（ALO）社　免疫染色のトラブルシューティング

Alomone社のすべての抗体は、ウェスタンブロッティングによる厳格なQC分析を受けています。各ロットをアフィニティカラムで精製し、分析は同じプロトコル、同じ条件で行っています。

また、前回のロットと比較して満足のいく結果が得られてから抗体をリリースしています。シグナルが得られない場合は、根本的な問題がある可能性があります。

• 一次抗体や二次抗体の使用量が不足している可能性があります。推奨されている抗体の希釈率に従うか、異なる抗体の希釈率をテストして、最適な抗体濃度を決定してください。
• 蛍光検出システムを使用している場合、コンジュゲートされた一次抗体または二次抗体を暗所に置いていない可能性があります。可能な限りこれらの抗体が光にさらされないようにしてください。
• 二次抗体が一次抗体に結合していない可能性があります。二次抗体が、一次抗体のホスト動物の抗体に対するものであることをご確認ください。
• 抗体溶液に含まれるNaN₃が、時に問題を引き起こすことがあります。
• 固定方法がエピトープにダメージを与え、一次抗体がエピトープを認識できなくなっている可能性があります。固定時間を短くするか、抗原の賦活化を試してみてください。
• 検査対象のタンパク質がサンプル中に存在しないか、または非常に低いレベルで存在している可能性があります。
• 抗体のデータシートを確認して、実験対象の生物種との交差反応を確認ください。

バックグラウンドレベルが高いのは、一次抗体の濃度が最適でないこと、ブロッキング工程が不十分であること、あるいは抗体とブロッキング試薬の間に非特異的な結合があることなどが考えられます。

• 最適な濃度になるように一次抗体を希釈ください。最適な希釈率はデータシートに記載されていますが、ほとんどの一次抗体では1:100から始めることをお勧めします。蛍光体に直接結合した抗体の場合は、1:50〜1:60の希釈を推奨します。
• Tween-20は、シグナルを強め、非特異的な染色を抑える効果がございますので、抗体溶液や洗浄バッファーに0.1%〜0.5%の終濃度で添加してみてください。Tween-20は、Triton X-100のような他の界面活性剤よりも細胞に対するダメージが少ないです。
• 組織によっては内因性のアビジン結合能が存在するものがあります。この問題を解決するには、一次抗体に曝露する前に、非結合ストレプトアビジンを含む溶液で組織切片をインキュベートすることにより、内因性結合部位を飽和させます。
• サンプルのインキュベーション温度が高すぎる可能性があります。組織切片を4℃でインキュベートしてください。
• 固定時間が長すぎると、エピトープに影響を与え、バックグラウンドレベルが高くなることがあります。固定時間を短くしたり、温度を下げたり、固定液の濃度を下げたりし、固定プロトコルを最適化ください。一般的には、サンプルを4％パラホルムアルデヒド（PFA）で24〜72時間インキュベートします。サンプルが脾臓や肝臓などの血液の多い臓器である場合は、24時間後にPFAを交換することを推奨します。
• コーティングされたチャンバースライド上で細胞を培養した場合、抗体が表面に付着することがあります。この場合、バックグラウンドレベルに影響を与える可能性がありますので、別のコーティング液 (ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミンなど) を使用してみてください。

これは、薄切などで組織が損傷したためと考えられます。

• 再構成後の抗体溶液、特に再構成した抗体溶液を解凍した後に、抗体溶液中に凝集体が形成されることがあります。そのため、使用前にすべての抗体溶液を遠心することを推奨致します (10000×g、5分)。
• 切れ味の悪い刃で切片を作成すると、折れや気泡の原因となります。また、切片を厚く切りすぎると、解像が困難になることがあります。切片作成装置がよく整備され、プロトコルが最適化されていることをご確認ください。

浮遊切片は、スライドに貼り付けた切片に比べて、より効果的に染色されることがわかっています。スライドに切片を貼り付けた場合、切片の表面を越えての抗体のアクセスや浸透が制限されるためです。この問題は、抗体溶液中のTriton X-100の含有量を増やすことである程度解決することができます。しかし、Triton X-100は比較的刺激の強い界面活性剤であり、多すぎると抗原を劣化させる可能性があり、細胞外エピトープをターゲットとする抗体の場合には、この方法はあまりお勧めできません。