Atelerix（ATX）社　細胞保存・輸送用ハイドロゲル プロトコール

準備

以下については、キットに含まれておりませんので、事前にご準備ください。

• 21G 針
• 1 ml シリンジ
• 1000 µL及び200 µLマイクロピペット、チップ

手順

• ゲル化
1. 使用前にすべてのコンポーネントが室温まで平衡化されていることを確認し、クリーンベンチ内のすべてのステップを室温で実施する。
2. 1サンプルあたり0.275 mLの培地に、最終的に希望するカプセル化細胞密度の2倍の密度で細胞を再懸濁する。
   ※推奨されるカプセル化された細胞密度は、サンプルあたり最大1×10⁷cellsです。
3. 滅菌チューブ内の1 サンプルあたり 0.275 mL の細胞懸濁液に、Component A を 0.275 mL 添加する。
4. マイクロピペットを使用して5〜10回、または細胞が十分に懸濁するまで、ゆっくりと混合する。
5. 溶液を1 mLシリンジに充填する。
   メモ：溶液を出す前に、分注時に溶液の容量を完全にパージできるようにエアスペースがあることを確認してください。
6. 21Gの針を使用し、細胞/ゲル溶液0.5 mLを液面上約1〜2 cmの高さから、Component B にゆっくりと滴下し、ビーズを形成させる。
7. Component B 中のビーズを室温で8分間安定させる。
8. 1000 µLのピペットまたは注射針つきシリンジを使用して Component B を除外し、ピペットまたは注射針をチューブの内側に導いて、ゲル化したビーズが乱されないようにする。
9. ビーズを1 mLの培地で2分間洗浄する。
10. 5.5 mL の保存用培地に交換する前に洗浄液を除去する。
11. チューブをしっかりと密封し、適切な温度（冷蔵では2〜8℃、室温管理（CRT）包装では10〜20℃の間、または温度管理された部屋）で保管する。
    ※Atelerix社では、特定のセルタイプに適した保存温度を推奨しています。
• リリース
1. 使用前にすべてのコンポーネントが室温まで平衡化されていることを確認し、クリーンベンチ内のすべてのステップを室温で実施する。
2. ビーズから培地を除去し、5 mL の Dissolution Buffer を加える。
3. 穏やかに撹拌しながらビーズを最大10分間溶解させ、すべてのビーズが完全に溶解することを目視で確認する。
4. 直接完全な細胞懸濁液を使用するか、350RCFで5分間遠心分離して細胞を沈降させ、上清を除去し、選択した添加剤に細胞を再懸濁する。

準備

キットの構成品は、少なくとも使用20分前に4℃保存から取り出し、室温に戻してください。
以下については、キットに含まれておりませんので、事前にご準備ください。

• 接着細胞培養用 96well plate
• 1000 µL及び 200μLマイクロピペット、チップ
• 培養培地

手順

• ゲル化
1. 使用前にすべてのコンポーネントが室温まで平衡化されていることを確認し、クリーンベンチ内のすべてのステップを室温で実施する。
2. ゲル濃縮物を含むチューブに完全培養培地を直接添加し、ゲルA、ゲルB、および ゲルC を5倍希釈します。その後、10秒間ボルテックスして混和するまたは、ピペットで均一になるまで静かに混和する。
3. 細胞培養プレートの各ウェルから慎重に培養培地を取り除く。
4. 希釈したゲルA 溶液0.09 mLを各ウェルに加える。
5. 希釈したゲルB 溶液0.09 mLを静かに加える。
6. Gelation Buffer 1 (GB1)0.05 mL をゲル A/B 溶液の表面に滴下します。ゲル化には10分間程度かかります。
7. Gelation Buffer 2 (GB2)0.05 mL をゲル A/B 溶液の表面に滴下します。ゲル化には、さらに10分間程度かかります。
8. 各ウェルから GB1/GB2 混合液を除去し、1ウェルにつき 0.2 mL の培養培地で 5 分間洗浄する。
9. 培養培地を除去し、ゲル化した表面の中央に0.09 mLの希釈ゲルC 溶液を追加する。
10. プレートの表面にプレートシールを貼り、適切にシールされていることを確認する。
11. 蓋を元に戻して、光を避けて適切な温度で保管します。出荷前に4時間静置する。
    ※Atelerix社では、特定のセルタイプに適した保存温度を推奨しています。
• リリース
1. 使用前にすべてのコンポーネントが室温まで平衡化されていることを確認し、クリーンベンチ内のすべてのステップを室温で実施する。
2. プレートシールを外し、P200 チップを使用して Dissolution Buffer 0.1 mL を注入し、5 分間脱ゲル化する。
   ※注)ピペットの先端でゲル表面に穴を開け、Dissolution Bufferを注入する。
3. ウェルの内容物0.2 mLを除去する。
4. 0.2 mLのDissolution Bufferを加え、10分間脱ゲル化する。
5. 0.4 mL（各ウェルの残りの内容物）を除去する。
6. 各ウェルを培養培地に置き換える。
7. 4時間または一晩、通常の培養条件に戻す。

準備

キットの構成品は、少なくとも使用20分前に4℃保存から取り出し、室温に戻してください。
以下については、キットに含まれておりませんので、事前にご準備ください。

• 1000 µLマイクロピペット、チップ
• 培養培地
• 滅菌ピンセット

手順

• ゲル化
1. 使用前にすべてのコンポーネントが室温まで平衡化されていることを確認し、すべてのステップは室温下のクリーンベンチ内で実施する。
2. Gel Aの入ったバイアルに0.48 mLの培養培地を添加し、気泡が入らないように5~10回ピペットで均質になるまで静かに混合する。
3. GelBase Beadsを入れたチューブに0.6 mLの Gel A/培養培地溶液を加える。
4. ゲル全体にビーズが均一になるまで数回チューブを転倒混和し、GelBase BeadsをGel A/培養培地溶液全体に分散させる。
5. 滅菌ピンセットを使用して組織サンプルをGel A/培養培地溶液混合物の中に入れ、組織がゲルで完全に覆われていることを確認する。
   ※この操作は、GelBase BeadsとGel A/培養培地を混合してから20分以内に行う。
   ※推奨される組織サイズは、下表を参照。
   

   商品名	オルガノイド/スフェロイドのサイズ	1バイアルあたりの推奨数
   TIssueReady™-M (TR-MNS)	≤200 µm	≤250
   	≤1.5 mm	≤25
   TIssueReady™-L (TR-LNS)	≤200 µm	≤1,000
   	≤1.5 mm	≤100
   TissueReady™-XL (TR-XNS)	≤200 µm	≤4,500
   	≤1.5 mm	≤450

6. 蓋を元に戻し、しっかりと密閉する。（Gel Aは約30分以内に硬化し、サンプルは1時間後に出荷可能になる）。
7. 光を避け、適切な温度（下表参照）で保管する。
   

   試料タイプ	目的	推奨保存温度	保存期間
   組織	組織学的解析	2 - 8 °C	2 - 3 日間
   組織	細胞生存率	15 - 25 °C	4 - 5 日間
   組織	組織学的解析 ＆ 細胞生存率	15 - 25 °C	2 - 3 日間
   オルガノイド	細胞生存率	15 - 25 °C	5 日間

   ※Atelerix社では、特定の試料タイプに適した保存温度を推奨しています。最新の情報については、リンクをご参照ください。
• リリース
1. 使用前にすべてのコンポーネントが室温まで平衡化されていることを確認し、すべてのステップは室温下のクリーンベンチ内で実施する。
2. チューブの蓋を外し、針つきのシリンジまたは血清学的ピペットを使用してゲルを穿刺して、組織を乱さないように注意しながら1 mLのDissolution Buffer をゲルに注入する。
3. 10分間穏やかにチューブを転倒混和してゲルを溶解する。
4. 培養培地または緩衝液で組織を洗浄する。

準備

キットの構成品は、少なくとも使用20分前に4℃保存から取り出し、室温に戻してください。
以下については、キットに含まれておりませんので、事前にご準備ください。

• マイクロピペットおよびチップ、またはセロロジカルピペットおよびピペットフィラー
• 抗生物質・抗真菌剤（ThermoFisher Scientific 15240096）
  ※無菌環境外で使用する場合は、使用前にGel A に抗生物質・抗真菌剤溶液を添加することを強く推奨する。
• 細胞培養用培地
• 滅菌ピンセットまたはパスツールピペット
• シリンジおよび針（任意）

手順

• ゲル化
1. 使用前にすべてのコンポーネントが室温まで平衡化されていることを確認し、すべてのステップは室温下のクリーンベンチ内で実施する。
2. 0.6 mL のGel A溶液を GelBase Beads のチューブに加える。キャップを戻し、ゲル／ビーズ混合物を数回反転させてビーズを均一に分散させる。チューブを軽く弾いて内容物を底に落とし、直ちにステップ3に進む。
3. キャップを外し、サンプルをゲル／ビーズ混合物に完全に浸るように加える。この操作はステップ3から20分以内に行う。
4. キャップを戻し、しっかり密封する（ゲルは約30分でその場で硬化し、1時間後には輸送可能な状態になる）。
5. 光を避け、封入した組織種に推奨される温度（下表参照）で保存する。
   

   試料タイプ	目的	推奨保存温度	封入後の保存可能期間
   組織	組織学的解析	2 - 8 °C	2 - 3 日間
   組織	細胞生存率	15 - 25 °C	4 - 5 日間
   組織	組織学的解析 ＆ 細胞生存率	15 - 25 °C	2 - 3 日間

   ※Atelerix社では、特定の試料タイプに適した保存温度を推奨しています。最新の情報については、リンクをご参照ください。
• リリース
1. 使用前にすべてのコンポーネントが室温まで平衡化されていることを確認し、すべてのステップは室温下のクリーンベンチ内で実施する。
2. ピペットチップまたは針付きシリンジを用いてゲルを突き刺し、1 mLのDissolution Buffer をバイアルの底部に注入する。このときサンプルを乱さないよう注意する。Dissolution Buffer を加えながら、液漏れを防ぐためにピペットチップまたは針を引き抜く。
3. キャップを戻し、10分間チューブを時々静かに転倒または揺動させ、ゲルを溶解する。ゲルが完全に溶解したら、滅菌ピンセットまたはパスツールピペットでサンプルを回収する（オルガノイドを保持する場合はパスツールピペットまたはマイクロピペットを使用する）。
4. サンプルを培地またはバッファー溶液で洗浄し、以降の工程に進む。

準備

以下については、キットに含まれておりませんので、事前にご準備ください。

• 1000 µLマイクロピペット、チップ
• 培養培地

手順

• ゲル化
1. 使用前にすべてのコンポーネントが室温まで平衡化されていることを確認し、すべてのステップは室温下のクリーンベンチ内で実施する。
2. 細胞を適切な容量の培地（下表参照）に懸濁し、細胞が十分に均一に分散するようにする。
   

   細胞径	細胞種の例	推奨細胞充填量 （1封入あたり）
   4-10 µm	リンパ球 （例：T細胞、PBMCなど）	2 x 107 cells
   11-15 µm	線維芽細胞 CHO細胞 HEK細胞	1 x 107 cells 以下
   16-30 µm	間葉系幹細胞 単球 肝細胞	1 x 107 cells 以下

   ※CytoStor™では保存できる細胞数の下限を設定しておりませんが、遠心後に容易に回収できるだけの十分な細胞数を使用することを推奨します。
3. 0.48 mLの細胞懸濁液を 0.12 mLのGel Aが入ったバイアルに加える。
4. 気泡が入らないように注意しながら、ピペットを用いてやさしく混合し、均一になるまで撹拌する。
5. 0.6 mLの細胞／Gel A混合液をCytoStorバイアルに加える。
6. キャップを戻し、チューブを数回静かに転倒させてゲル／ビーズ混合物を均一に分散させる。チューブを軽く弾いて内容物を底に落とし、しっかり密封する（ゲルは約30分で硬化し、1時間後に出荷可能となる）。
7. 封入した細胞種に推奨される温度（下表参照）で、光を避けてポリスチレン容器内に保存する。
   

   推奨保存温度と保存期間

   細胞タイプ	推奨保存温度	保存期間
   末梢血単核細胞	2-8 ℃	3日間
   Jurkat細胞	15-25 ℃	14日間
   間葉系幹細胞	15-20 ℃	21日間
   単球	2-8 ℃	5日間
   線維芽細胞	15-20 ℃	14日間

   ※Atelerix社では、特定の細胞タイプに適した保存温度を推奨しています。最新の情報については、リンクをご参照ください。

• リリース
1. 使用前にすべてのコンポーネントが室温まで平衡化されていることを確認し、すべてのステップは室温下のクリーンベンチ内で実施する。
2. ピペットチップまたは針付きシリンジを用い、ゲルを突き刺して1 mLの Dissolution Buffer をゲルの底部に注入する。
3. キャップを戻し、チューブを時々静かに転倒または揺動させながら10 分間置き、ゲルを溶解する
4. 350 RCFで5分間遠心して細胞を沈降させ、上清を除去した後、培養培地に再懸濁する。

準備

以下については、キットに含まれておりませんので、事前にご準備ください。

• 1000 µLマイクロピペット、チップ
• 培養培地

手順

• ゲル化
1. 使用前にすべてのコンポーネントが室温まで平衡化されていることを確認し、すべてのステップは室温下のクリーンベンチ内で実施する。
2. ウイルスを適切な容量の培地（下表参照）に懸濁し、ウイルスが十分に均一に分散するようにする。
   

   サンプル	ウイルス種の例	推奨ウイルス充填量 （1封入当たり）
   ウイルス	Lentivirus, Coronavirus, viral vectors	1 x 109 IFU

   ※CytoStor™では保存できるウイルスの下限を設定しておりませんが、遠心後に容易に回収できるだけの十分なウイルス量を使用することを推奨します。
3. 0.48 mLのウイルス懸濁液を 0.12 mLのGel Aが入ったバイアルに加える。
4. 気泡が入らないように注意しながら、ピペットを用いてやさしく混合し、均一になるまで撹拌する。
5. 0.6 mLのウイルス／Gel A混合液をCytoStorバイアルに加える。
6. キャップを戻し、チューブを数回静かに転倒させてゲル／ビーズ混合物を均一に分散させる。チューブを軽く弾いて内容物を底に落とし、しっかり密封する（ゲルは約30分で硬化し、1時間後に出荷可能となる）。
7. 封入した細胞種に推奨される温度（下表参照）で、光を避けてポリスチレン容器内に保存する。
   

   推奨保存温度と保存期間

   試料タイプ	推奨保存温度	保存期間
   ウイルス	15-25 ℃	14日間

   ※Atelerix社では、特定の試料タイプに適した保存温度を推奨しています。最新の情報については、リンクをご参照ください。

• リリース
1. 使用前にすべてのコンポーネントが室温まで平衡化されていることを確認し、すべてのステップは室温下のクリーンベンチ内で実施する。
2. キャップを戻し、チューブを時々静かに転倒または揺動させながら10 分間置き、ゲルを溶解する
3. ゲル溶解後のウイルスは以下のいずれかの方法で処理する：
   a. 超遠心により沈降させる。超遠心後、上清を除去し、希望する培地に再懸濁する。
   b. 使用する培地で希釈する（最低4倍以上の希釈を推奨する）。

準備

以下については、キットに含まれておりませんので、事前にご準備ください。

• 1000 µLマイクロピペット、チップ
• 10 mL、25 mL のセロロジカルピペットおよびピペット補助器具
• ヘパリンナトリウム入り全血（0.5、1、3、5 または 10 mL）
• 15 mL、50 mL 遠心チューブ
• 細胞培養用培地または洗浄用バッファー
• SepMate™ PBMC 分離チューブ（PBMCを分離する場合）

手順

• ゲル化
1. 使用前にすべてのコンポーネントが室温まで平衡化されていることを確認し、ゲルがチューブの底に沈んでいることを確認する。すべてのステップは室温下のクリーンベンチ内で実施する。
2. 0.5 mLの全血サンプルを、0.125 mLのGel Aを含むバイアルに加える。
3. ピペットで穏やかに混合し、均一になるまで攪拌する。このとき、気泡が入らないように注意する。
4. 1000 µL ピペットを用いて、0.625 mLの全血/Gel A混合液を GelBase Beadsにゆっくりと加える。
5. チューブにキャップをし、ゲル/ビーズ混合物を数回静かに転倒させ、ビーズがゲル全体に均一に分散させる。その後、密封されていることを確認し、チューブを軽く弾いて内容物を底に落とす。（ゲルは約30分以内に硬化し、1時間後には輸送可能な状態になる）。
6. 光を避け、ポリスチレン製の箱に入れて 2-8℃の範囲で保存してください。
• リリース
1. 使用前にすべてのコンポーネントが室温まで平衡化されていることを確認し、すべてのステップは室温下のクリーンベンチ内で実施する。
2. チューブのキャップを外し、1000 µL ピペットを用いてゲルを突き刺しながら 1 mLの Dissolution Buffer をゲルに注入する。
3. 10分間穏やかにチューブを転倒混和してゲルを溶解する。
をゲルの底に注入する。
4. チューブにキャップを戻し、10分間チューブを静かに転倒または揺動させてゲルを溶解する。
5. ピペッティングにより、放出された全血をMACS® SmartStrainer（100 µm）に通して15 mL遠心チューブに移し、GelBase Beadsをろ過する。
• SepMate™ チューブを用いたPBMCの分離
  全血の放出後に末梢血単核球（PBMC）を分離する場合には、SepMate™ PBMC Isolation Tubes の使用を推奨する。SepMate™ チューブを用いることで、わずか15分で再現性の高い簡便な PBMC 分離が可能となる。

準備

以下については、キットに含まれておりませんので、事前にご準備ください。

• Leukopak 洗浄用バッファー［推奨：RPMI 1640 + 2% FBS + 1 mM EDTA］
• 細胞培養用培地
• 血液バッグ用チューブシーラー（LS-30, LS-70）
• 実験用ロッキングシェーカー
• クラス II 微生物安全キャビネット（任意）
• 500 mL ポリスチレン製保存容器（任意）
• 50 mL 遠心チューブ
• 50 mL 遠心チューブ用ラック
• 10–50 mL セロロジカルピペットおよびピペットコントローラー
• 遠心機
• Category B 感染性物質用バッグ
• 吸収パッド
• 輸送容器（適切な温度を維持できるもの）

手順

• ゲル化
ステージ 1
1. Gel Aを冷蔵保存から取り出し、30分間以上室温において平衡化する。
2. 通常通りLeukapheresisの準備をする。採取物を適切な滅菌容器に移す。
3. 10 mLの白血球成分を Gel A を含むチューブに加え、10 mLセロロジカルピペットを用いて十分に混合する。
ステージ 2
1. 12.5 mLの Gel A/白血球成分混合液を、10 mLまたは25 mLのセロロジカルピペットを用いて GelBASE beads を含むチューブに移す。
2. チューブを手で揺らし、ビーズが白血球成分全体に均一に分布するようにする。
ステージ 3
1. サンプルを輸送用に準備する。Category B感染性物質用バッグに吸収パッドとともに入れる。
2. バッグを密封し、外装輸送容器の中に平らに置く。
3. 特別な指示がない限り、採取物を温暖な室温（20–25℃）で輸送・保存する。
4. 封入した細胞種に推奨される温度で光を避けて保存する。保存温度と時間に関する最新の推奨事項は、下記の専用ウェブページを参照する。
   

   細胞タイプ	推奨保存条件	保存期間
   T 細胞	25℃	5日間
   NK 細胞	25℃	5日間
   B 細胞	2-8℃	5日間
   単球	2-8℃	5日間

   ※Atelerix社では、細胞タイプに適した保存温度を推奨しています。最新の情報については、こちらのリンクをご参照ください。
• 放出
ステージ 1
1. Dissolution Buffer を冷蔵保存から取り出し、少なくとも30分間室温に置く。
2. ゲル化したアフェシレーシス検体を輸送容器から取り出し、クラス II 微生物安全キャビネットに移す。
3. ゲル化したアフェシレーシスを転倒して軽く叩きながら50 mL遠心チューブに移す。
4. 検体が入っていたチューブに20 mLの Dissolution Buffer を加えて洗浄し、ゲル化したアフェレーシスを含む50 mL遠心チューブに移す。キャップをしっかり閉め、密封を確認する。
5. ロッキングシェーカーを40 rpmに設定し、30分間置いてゲルを溶解し、白血球成分を放出する。
ステージ 2
1. 溶解したアフェレーシス検体を含む50 mL遠心チューブをクラス II 微生物安全キャビネットに置く。
2. キャップを外した50 mL遠心チューブを2本準備し、セルストレーナーを装着する。
3. 溶解したアフェレーシス検体をセルストレーナーに注ぎ入れる。セルストレーナー内の試料は、膜に触れないように3 mLパスツールピペットを用いてかき混ぜ、試料の通過を促す。
4. すべてのアフェレーシスを濾過したら、10 mLのleukopak 洗浄バッファーを10 mLセロロジカルピペットで加え、セルストレーナー内の GelBASE beads を洗浄する。
5. GelBASE beads を含むセルストレーナーを適切な方法で廃棄する。
6. 洗浄済みのアフェレーシス検体を 350 × g、10 分間、減速をソフトに設定した遠心機で沈降させる。
7. 白血球成分を適切な量の細胞培養培地で再懸濁し、後続の工程に移る。

準備

以下については、キットに含まれておりませんので、事前にご準備ください。

• Leukopak 洗浄用バッファー［推奨：RPMI 1640 + 2% FBS + 1 mM EDTA］
• 細胞培養用培地
• 血液バッグ用チューブシーラー（LS-30, LS-70）
• 実験用ロッキングシェーカー
• クラス II 微生物安全キャビネット（任意）
• 500 mL ポリスチレン製保存容器（任意）
• 50 mL 遠心チューブ
• 50 mL 遠心チューブ用ラック
• 10–50 mL セロロジカルピペットおよびピペットコントローラー
• 遠心機
• Category B 感染性物質用バッグ
• 吸収パッド
• 輸送容器（適切な温度を維持できるもの）

手順

• ゲル化
ステージ 1
1. Leukopakを準備する。接続チューブはバッグの近くで閉じてクリップで留め、使用済みのポートもすべて閉じる。
2. Leukopakの未使用ポートの保護タブを外す。
3. Bag A（Gel A入り）に接続されたスパイクの保護カバーを外し、Leukopakの未使用ポートにスパイクを刺し、正しく挿入されていることを確認する。
   ※Leukopakにスパイク付きの既存のトランスファーラインがある場合は、それを用いて未使用ポートからBag Aに移送することが可能。また、セロロジカルピペットとピペットコントローラーを用いて未使用ポートに材料を移送することも可能。
4. Leukopakの内容物を約10秒間やさしくもみほぐして流動化し、スパイク接続を通じて Bag A に排出し、トランスファーチューブをクリップで閉じる。
5. 必要に応じて、2つのバッグを接続しているチューブを閉じ、互いに切り離す。
6. Bag A の内容物を約30秒間やさしくもみほぐしながらバッグを反転させ、内容物が完全に混合されるようにする。
ステージ 2
1. Bag B（GelBASE beads入り）内のビーズをやさしくもみほぐして、均一に分散させる。
2. Bag A の未使用ポートの保護タブを外す。
3. Bag B に接続されたスパイクの保護カバーを外し、Bag A の未使用ポートにスパイクを刺し、正しく挿入されていることを確認する。
4. Bag A の内容物を約10秒間やさしくもみほぐして流動化し、Bag A と Bag B をつなぐラインのクリップを外す。スパイク接続を通じて内容物を Bag B に排出し、排出後に Bag B 側のラインにクリップを戻す。
5. 2つのバッグをつなぐチューブを閉じ、バッグを切り離す。
6. Bag B をロッキングシェーカーに置き、30 rpmに設定して15分間混合する。
7. Bag B をベンチに平らに置き、室温で1時間静置する。攪拌は避ける。
8. Bag B のみを輸送する。他の材料は適切な方法で廃棄する。
ステージ 3
1. Bag B を輸送用に準備する。吸収パッドとともにCategory B 感染性物質用バッグに入れる。
2. バッグを密封し、Bag C（Dissolution Buffer）とともに外装輸送容器の中に平らに配置する。
3. 特別な指示がない限り、Leukopak を温かい室温（20–25℃）で輸送または保存する。
4. 封入した細胞種に推奨される温度で、光を避けて保存する。最新の推奨事項は以下のウェブページを参照する。
   

   細胞タイプ	推奨保存条件	保存期間
   T 細胞	25℃	5日間
   NK 細胞	25℃	5日間
   B 細胞	2-8℃	5日間
   単球	2-8℃	5日間

5. ※Atelerix社では、細胞タイプに適した保存温度を推奨しています。最新の情報については、こちらのリンクをご参照ください。
• リリース
ステージ 1

1. Bag B（ゲル化検体）および Bag C（Dissolution Buffer）を輸送容器から取り出す。
2. Bag B の未使用ポートの保護タブを外す。
3. Bag C に接続されたスパイクの保護カバーを外し、Bag B の未使用ポートにスパイクを刺し、正しく挿入されていることを確認する。
4. Bag C 側のクリップを外し、スパイク接続を通じて Dissolution Buffer を Bag C から Bag B に排出し、排出後に Bag B 側の近くでクリップを取り付ける。
5. 必要に応じて、2つのバッグを接続しているチューブを閉じ、互いに切り離す。
6. Bag B をロッキングシェーカーに置き、40 rpmに設定して45分間混合し、ゲルを溶解する。ゲルが残っている場合は、やさしくもみほぐして完全に分散させる。

ステージ 2

1. Bag B をロッキングシェーカーから取り外し、クラス II 微生物安全キャビネット内に設置する。
2. 血液投与セット（blood administration set）を包装から取り出し、チューブが固定されていることを確認し、スパイクの保護カバーを外す。
3. Bag B のポートから既存のスパイクを取り外し、血液投与セットのスパイクを挿入する。
4. Bag B を高い位置に吊るす。
5. 血液投与セットのラインのキャップを外す。
6. ラインの留め具を外し、コレクション容器に液を濾過しながら流す。
7. 溶解済み Leukopak内容物に同量の洗浄バッファーを加える（例：50 mL遠心チューブの場合、25 mLの洗浄バッファーを加える）。
8. 洗浄後の内容は、以降の工程に直接使用するか、白血球を回収するために沈降させる。

※白血球の沈降には、350 × g、10分間、緩やかな減速（soft deceleration）に設定した遠心機の使用を推奨する。