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Bioruptor 使用文献&参考資料リスト

記事ID : 5381

3. アプリケーション


1. マウス心筋組織の破砕

● 目的:マウス心筋組織から総タンパク質を抽出する。
● 処理条件

使用機種 UCD-250 型
サンプル マウス C57BL 心筋組織
サンプル調製法 湿重量 20 mg の心筋組織を 3 mm角に切断し、IP buffer 500 uL に加えてサンプルとした。
使用チューブ 1.5 mL チューブ (Eppendorf 社製)
超音波処理条件 出力 310 W, 30 sec ON/30 sec OFF/Total 15 min, 冷水循環器 (# CP-80R) で水温は 4℃ に維持。
タンパク濃度定量法 超音波処理後のサンプルを 2,000 x g, 3 min, 4℃ で遠心して上清を回収した。BCA protein assay kit を用いて上清のタンパク質定量を行った。

 

● 結果:処理時間に応じて心筋組織からタンパク質を抽出することができた。

処理時間 5min 15min
n数 6 6
平均タンパク質濃度(mg/mL) 2.39 5.86
標準偏差 0.31 0.33
bioruptor_001.jpg

2. UCW-310 によるHeLa 細胞の破砕

● 目的:HeLa 細胞から総タンパク質を抽出する。
● 処理条件

使用機種 UCW-310 型
サンプル HeLa 細胞 (1 x 109 cells/mL)・250 uL
n 数 24 (左右のギヤ版に 12 本ずつセット)
使用チューブ 1.5 mL チューブ (Eppendorf 社製)
超音波処理条件 出力 310 W, 30 sec ON/30 sec OFF/Total 10 min, 冷水循環器 (# CP-80R) で水温は 4℃ に維持。
タンパク濃度定量法 上記実験と同様。

 

● 結果:全てのサンプルからほぼ均一にタンパク質を抽出することができた。

  1回目 2回目
平均タンパク質濃度 (mg/mL) 3.26 3.36
標準偏差 0.25 0.2

3. GST 融合タンパク (70 kDa) の精製

機種 UCD-250型
実験方法 IPTG 誘導を行った大腸菌ペレットに 12mL のバッファーを加え超音波処理する。その後 GST融合タンパクを Glutathione Sepharose® で精製する。
超音波処理条件 250 W, 20 sec ON/20 sec
OFF/Total 8 min
200 W/1min ON/1 min
OFF/Total 8 min
結果 BIORUPTORRはプローブタイプに比べて効率的に大腸菌を破砕することができた。

SEPHAROSE®はGE Healthcare社の登録商標です。

bioruptor_002.jpg

 

4. 出力200Wによる各種サンプル処理例

(1)大腸菌の破砕

サンプル 1 mL、2〜3×109 cells/mL
容器 10 mL チューブ
処理条件 (1)200 W, 30 sec ON/30 sec OFF/Total 4 min
(2)200 W, 30 sec ON/30 sec OFF/Total 8 min
結果 (1)95% 以上破砕
(2)100% 破砕
bioruptor_003.gif

 

(2)クロレラの破砕

10mL容器によるクロレラ細胞
(Chlorella kessleri 9.80(white mutant))の破砕に及ぼす試料容積の影響
超音波出力200W

bioruptor_004.gif

(3)サンプル処理例リスト(200W)

サンプル 容器 サンプル量および濃度 処理時間 破砕・溶解状況
1. マウスの心臓
(1mm角に切ったもの)
(1) 10mlスピッツ (1) 0.5ml (1) 10sec破砕×10sec休止×45回(15min) (1) ほぼ100%破砕
2.乳酸菌
(Lactobacillus,
Lactobacillus
acidophilus group菌)
(1) 10mlスピッツ (1) 0.7ml
濃度
10e10〜10e11/ml
(1) 20sec破砕×20sec休止15回(10min)  
3.培養細胞
(Chinese hamster
lung
fibroblast)
(1) 1.5mlチューブ (1) 0.2〜0.3ml
細胞浮遊液
(in PBS pH7.4)
(1) 10sec破砕×20sec休止×25回 (12.5min)  
4.脂溶性酵素基質のミセル化 (1) 1.5mlチューブ (1) 0.2〜0.3ml (1) 10sec破砕×20sec休止×25回 (12.5min)  
5.アデノウィルス培養細胞
(293細胞)
(1) 50mlスピッツ
(ファルコン社
コーニング社住友社製等)
(1) 15ml (1) 30sec破砕×30sec休止×4回(4min)  
6.MRSA
(Staphylococcus
aureus) の破砕
(1) 10mlスピッツ (1) 200ul濃度一昼夜培養後その1/200容量をとり37℃でO.D600=2.7まで培養し集菌洗浄後50mM/HCL(pH7.5)5mM EDTAで1/5にサスペンドしたもの (1) 30sec破砕×30sec休止×40回(40 min) (1) 生菌率1% Nite:50ul
(1.5mlチューブ)では上記条件で生菌率は60%。
7.大腸菌 1)
(1) 50mlスピッツ
(標準タイプ)
(2) 50mlファルコンチューブ
(1) 20ml
(2) 15ml
サンプル濃度 上記両ケース共500mlで
O.D1.1-1.2で集菌しバッファーに調合し
25-30mlのサンプルを得る
(1) 20sec破砕×20sec休止×6回(4min)
(2) 20sec破砕×20sec休止×12回(8min)
両条件でほぼ同程度(約90%)の破砕結果が得られた。
8.大腸菌 2) 
(1) 10mlスピッツ
(2) 10mlスピッツ
(1) 1ml
(2) 1ml
(1)濃度
2-3×10e9個/ml
(2)濃度
10e7−10e8個/ml
(1) 30sec破砕×30sec休止×4回(4min)
(1) 30sec破砕×30sec休止×8回(8min)
(2) 30sec破砕×30sec休止×4回(4min)
(1) 95%以上破砕
(1) 100%破砕
(2) 100%破砕
9.大腸菌
(DH5α/pT7Blue-xysB cells)
1)
(1) 10mlスピッツ
(2) 10mlスピッツ
(3) 10mlスピッツ
(1) 0.5ml
(2) 1ml
(3) 2ml
(1)(2)(3)濃度は同一3×10e9個/ml
(1) 30sec破砕×30sec休止×5回(5min)、30sec破砕×30sec休止×10回(10min)
(2) 30sec破砕×30sec休止×5回(5min)、30sec破砕×30sec休止×10回(10min)
(3) 30sec破砕×30sec休止×5回(5min)、30sec破砕×30sec休止×10回(10min)
(1) 95%以上破砕、100%破砕
(2) 約75%破砕、約90%破砕
(3) 約50%破砕、約75%破砕
10.大腸菌
(DH5α/pT7Blue-xysB cells)
2)
(1) 1.5mlチューブ
(TPX製)
(2) 1.5mlチューブ
(TPX製)
(1)300ul
(2)250ul
(1)濃度
3×10e9個/ml
(2)濃度
3×10e9個/ml
(1) 30sec破砕×30sec休止×5回(5min)、30sec破砕×30sec休止×10回(10min)
(2) 30sec破砕×30sec休止×5回(5min、30sec破砕×30sec休止×10回(10min)
(1) 90%以上破砕、95%以上破砕
(2) 約60%破砕、約85%破砕
11.クロレラ
Chlorella kessleri
211-11h
(wild type, green), C.kessleri 9.8 (white mutant)
1)
(1) 1.5mlチューブ
(1)100ul
(1)濃度
100ulPCV/ml
(1) 30sec破砕×30sec休止×30回(30min) (1) 95%以上破砕
12.クロレラ
Chlorella kessleri
211-11h
(wild type, green), C.kessleri 9.8 (white mutant)
2)
(1) 10mlスピッツ
(2) 10mlスピッツ
(3) 10mlスピッツ
(1) 0.5ml
(2) 1ml
(3) 2ml
(1)(2)(3)濃度は同一 100ulPCV/ml
(1) 30sec破砕×30sec休止×1回(1min)、
30sec破砕×30sec休止×3回(3min)
(2) 30sec破砕×30sec休止×1回(1min)、
30sec破砕×30sec休止×3回(3min)
(3) 30sec破砕×30sec休止×1回(1min)、
30sec破砕×30sec休止×3回(3min)
(1) 80%破砕、95%破砕
(2) 60%破砕、92%破砕
(3) 30%破砕、70%破砕
13.クロレラ
Chlorella kessleri
211-11h
(wild type, green), C.kessleri 9.8 (white mutant)
3)
(1) 50mlスピッツ
(2) 50mlスピッツ
(1) 10ml
(2) 20ml
(1)(2)濃度は同一100ulPCV/ml
(1) 30sec破砕×30sec休止×10回(10min)
(2) 30sec破砕×30sec休止×10回(10min)
(1) 90%破砕
(2) 90%破砕
14.DNA(マウス genomic DNA)の切断 1)
(1) 1.5mlチューブ
(6本懸け)
(1) 50ul
濃度 不明
(1) 30sec破砕×30sec休止×3回(切断サイズにより調整) (3min) (1) 1kbpを中心に10kbpから100bpの範囲でブロードに切断
15.DNA(マウス genomic DNA)の切断 2)
(1) 0.5mlチューブ
(12本懸け)
(1) 20ul
濃度 不明
(1) 30sec破砕×30sec休止×3回(切断サイズにより調整)(3min) (1) 1kbpを中心に10kbpから100bpの範囲でブロードに切断
16.RNAの抽出(RNase-richな抗酸球から)
細胞工学 Vol20 No5 2001 p752参照
(1) 10ml スピッツ (1) 1ml
濃度 1×10e6個(抗酸球はD16negative selectionで100%純度に分離後サイトカイン添加培地で6時間cultureし軽く遠心してペレットにしTRI Reagent 1mlを加えてすばやくVortexのHiスピードで15秒間かけ全体を均一化しBioruptorにかける。)
(1)@130W 15sec破砕×15sec休止×2回(1min)  
17.試薬の溶解(コルチゾールデキサメサゾン等難水溶性の試薬)。 ルチゾールの水への溶解 (1) 15mlチューブ (1) 12.5mlにHydrocortisolを0.4mg加えて溶解(10e-4mol) (1) @200W 6sec破砕×6sec休止×12回(2.4min) (1) 溶解し変性もなかった。
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