技術情報
Bioruptor 使用文献＆参考資料リスト
記事ID ： 5381
3. アプリケーション
● 目的：マウス心筋組織から総タンパク質を抽出する。
● 処理条件
| 使用機種 | UCD-250 型 |
|---|---|
| サンプル | マウス C57BL 心筋組織 |
| サンプル調製法 | 湿重量 20 mg の心筋組織を 3 mm角に切断し、IP buffer 500 uL に加えてサンプルとした。 |
| 使用チューブ | 1.5 mL チューブ (Eppendorf 社製) |
| 超音波処理条件 | 出力 310 W, 30 sec ON/30 sec OFF/Total 15 min, 冷水循環器 (# CP-80R) で水温は 4℃ に維持。 |
| タンパク濃度定量法 | 超音波処理後のサンプルを 2,000 x g, 3 min, 4℃ で遠心して上清を回収した。BCA protein assay kit を用いて上清のタンパク質定量を行った。 |
● 結果：処理時間に応じて心筋組織からタンパク質を抽出することができた。
| 処理時間 | 5min | 15min |
|---|---|---|
| n数 | 6 | 6 |
| 平均タンパク質濃度(mg/mL) | 2.39 | 5.86 |
| 標準偏差 | 0.31 | 0.33 |
● 目的：HeLa 細胞から総タンパク質を抽出する。
● 処理条件
| 使用機種 | UCW-310 型 |
|---|---|
| サンプル | HeLa 細胞 (1 x 109 cells/mL)・250 uL |
| n 数 | 24 (左右のギヤ版に 12 本ずつセット) |
| 使用チューブ | 1.5 mL チューブ (Eppendorf 社製) |
| 超音波処理条件 | 出力 310 W, 30 sec ON/30 sec OFF/Total 10 min, 冷水循環器 (# CP-80R) で水温は 4℃ に維持。 |
| タンパク濃度定量法 | 上記実験と同様。 |
● 結果：全てのサンプルからほぼ均一にタンパク質を抽出することができた。
| 1回目 | 2回目 | |
|---|---|---|
| 平均タンパク質濃度 (mg/mL) | 3.26 | 3.36 |
| 標準偏差 | 0.25 | 0.2 |
| 機種 | UCD-250型 | |
|---|---|---|
| 実験方法 | IPTG 誘導を行った大腸菌ペレットに 12mL のバッファーを加え超音波処理する。その後 GST融合タンパクを Glutathione Sepharose® で精製する。 | |
| 超音波処理条件 | 250 W, 20 sec ON/20 sec OFF/Total 8 min |
200 W/1min ON/1 min OFF/Total 8 min |
| 結果 | BIORUPTORRはプローブタイプに比べて効率的に大腸菌を破砕することができた。 | |
SEPHAROSE®はGE Healthcare社の登録商標です。
| サンプル | 1 mL、2〜3×109 cells/mL |
|---|---|
| 容器 | 10 mL チューブ |
| 処理条件 | (1)200 W, 30 sec ON/30 sec OFF/Total 4 min |
| (2)200 W, 30 sec ON/30 sec OFF/Total 8 min | |
| 結果 | (1)95% 以上破砕 |
| (2)100% 破砕 |
10ｍL容器によるクロレラ細胞
（Chlorella kessleri 9.80（white mutant））の破砕に及ぼす試料容積の影響
超音波出力200W
| サンプル | 容器 | サンプル量および濃度 | 処理時間 | 破砕・溶解状況 |
|---|---|---|---|---|
| 1. マウスの心臓 (1mm角に切ったもの) |
(1) 10mlｽﾋﾟｯﾂ | (1) 0.5ml | (1) 10sec破砕×10sec休止×45回(15min) | (1) ほぼ100%破砕 |
| 2.乳酸菌 （Lactobacillus, Lactobacillus acidophilus group菌） |
(1) 10mlｽﾋﾟｯﾂ | (1) 0.7ml 濃度 10e10〜10e11／ml |
(1) 20sec破砕×20sec休止15回（10min） | |
| 3.培養細胞 （Chinese hamster lung fibroblast） |
(1) 1.5mlﾁｭｰﾌﾞ | (1) 0.2〜0.3ml 細胞浮遊液 （in PBS pH7.4） |
(1) 10sec破砕×20sec休止×25回 (12.5min) | |
| 4.脂溶性酵素基質のミセル化 | (1) 1.5mlﾁｭｰﾌﾞ | (1) 0.2〜0.3ml | (1) 10sec破砕×20sec休止×25回 (12.5min) | |
| 5.アデノウィルス培養細胞 （293細胞） |
(1) 50mlｽﾋﾟｯﾂ (ﾌｧﾙｺﾝ社 ｺｰﾆﾝｸﾞ社住友社製等) |
(1) 15ml | (1) 30sec破砕×30sec休止×4回（4min) | |
| 6.MRSA (Staphylococcus aureus) の破砕 |
(1) 10mlｽﾋﾟｯﾂ | (1) 200ul濃度一昼夜培養後その1/200容量をとり37℃でO.D600=2.7まで培養し集菌洗浄後50mM/HCL(pH7.5)5mM EDTAで1/5にｻｽﾍﾟﾝﾄﾞしたもの | (1) 30sec破砕×30sec休止×40回(40 min) | (1) 生菌率1% Nite:50ul (1.5mlﾁｭｰﾌﾞ)では上記条件で生菌率は60%。 |
| 7.大腸菌 | １） (1) 50mlｽﾋﾟｯﾂ （標準ﾀｲﾌﾟ） (2) 50mlﾌｧﾙｺﾝﾁｭｰﾌﾞ |
(1) 20ml (2) 15ml ｻﾝﾌﾟﾙ濃度 上記両ｹｰｽ共500mlで O.D1.1-1.2で集菌しﾊﾞｯﾌｧｰに調合し 25-30mlのｻﾝﾌﾟﾙを得る |
(1) 20sec破砕×20sec休止×6回(4min) (2) 20sec破砕×20sec休止×12回(8min) |
両条件でほぼ同程度(約90%)の破砕結果が得られた。 |
| 8.大腸菌 | 2) (1) 10mlｽﾋﾟｯﾂ (2) 10mlｽﾋﾟｯﾂ |
(1) 1ml (2) 1mｌ (1)濃度 2-3×10e9個/ml (2)濃度 10e7−10e8個/ml |
(1) 30sec破砕×30sec休止×4回(4min) (1) 30sec破砕×30sec休止×8回(8min) (2) 30sec破砕×30sec休止×4回(4min) |
(1) 95%以上破砕 (1) 100%破砕 (2) 100%破砕 |
| 9.大腸菌 (DH5α/ｐT7Blue-xysB cells) |
１） (1) 10mlｽﾋﾟｯﾂ (2) 10mlｽﾋﾟｯﾂ (3) 10mlｽﾋﾟｯﾂ |
(1) 0.5ml (2) 1ml (3) 2ml (1)(2)(3)濃度は同一3×10e9個/ml |
(1) 30sec破砕×30sec休止×5回(5min)、30sec破砕×30sec休止×10回(10min） (2) 30sec破砕×30sec休止×5回(5min)、30sec破砕×30sec休止×10回(10min） (3) 30sec破砕×30sec休止×5回(5min)、30sec破砕×30sec休止×10回(10min） |
(1) 95%以上破砕、100%破砕 (2) 約75%破砕、約90%破砕 (3) 約50%破砕、約75%破砕 |
| 10.大腸菌 (DH5α/ｐT7Blue-xysB cells) |
2) (1) 1.5mlﾁｭｰﾌﾞ (TPX製) (2) 1.5mlﾁｭｰﾌﾞ (TPX製) |
(1)300ul (2)250ul (1)濃度 3×10e9個/ml (2)濃度 3×10e9個/ml |
(1) 30sec破砕×30sec休止×5回(5min)、30sec破砕×30sec休止×10回(10min） (2) 30sec破砕×30sec休止×5回(5min、30sec破砕×30sec休止×10回(10min） |
(1) 90%以上破砕、95%以上破砕 (2) 約60%破砕、約85%破砕 |
| 11.クロレラ Chlorella kessleri 211-11h (wild type, green), C.kessleri 9.8 (white mutant) |
1) (1) 1.5mlﾁｭｰﾌﾞ |
(1)100ul (1)濃度 100ulPCV/ml |
(1) 30sec破砕×30sec休止×30回(30min) | (1) 95%以上破砕 |
| 12.クロレラ Chlorella kessleri 211-11h (wild type, green), C.kessleri 9.8 (white mutant) |
2) (1) 10mlｽﾋﾟｯﾂ (2) 10mlｽﾋﾟｯﾂ (3) 10mlｽﾋﾟｯﾂ |
(1) 0.5ml (2) 1ml (3) 2ml (1)(2)(3)濃度は同一 100ulPCV/ml |
(1) 30sec破砕×30sec休止×1回(1min)、 30sec破砕×30sec休止×3回(3min) (2) 30sec破砕×30sec休止×1回(1min)、 30sec破砕×30sec休止×3回(3min) (3) 30sec破砕×30sec休止×1回(1min)、 30sec破砕×30sec休止×3回(3min) |
(1) 80%破砕、95%破砕 (2) 60%破砕、92%破砕 (3) 30%破砕、70%破砕 |
| 13.クロレラ Chlorella kessleri 211-11h (wild type, green), C.kessleri 9.8 (white mutant) |
3) (1) 50mlｽﾋﾟｯﾂ (2) 50mlｽﾋﾟｯﾂ |
(1) 10ml (2) 20ml (1)(2)濃度は同一100ulPCV/ml |
(1) 30sec破砕×30sec休止×10回(10min) (2) 30sec破砕×30sec休止×10回(10min) |
(1) 90%破砕 (2) 90%破砕 |
| 14.DNA（ﾏｳｽ genomic DNA）の切断 | 1) (1) 1.5mlﾁｭｰﾌﾞ (6本懸け) |
(1) 50ul 濃度 不明 |
(1) 30sec破砕×30sec休止×3回(切断ｻｲｽﾞにより調整) (3min) | (1) 1kbpを中心に10kbpから100bpの範囲でブロードに切断 |
| 15.DNA（ﾏｳｽ genomic DNA）の切断 | 2) (1) 0.5mlﾁｭｰﾌﾞ (12本懸け) |
(1) 20ul 濃度 不明 |
(1) 30sec破砕×30sec休止×3回（切断ｻｲｽﾞにより調整）(3min) | (1) 1kbpを中心に10kbpから100bpの範囲でブロードに切断 |
| 16.RNAの抽出（RNase-richな抗酸球から） 細胞工学 Vol20 No5 2001 p752参照 |
(1) 10ml ｽﾋﾟｯﾂ | (1) 1ml 濃度 1×10e6個（抗酸球はD16negative selectionで100%純度に分離後ｻｲﾄｶｲﾝ添加培地で6時間cultureし軽く遠心してﾍﾟﾚｯﾄにしTRI Reagent 1mlを加えてすばやくVortexのHiｽﾋﾟｰﾄﾞで15秒間かけ全体を均一化しBioruptorにかける。） |
(1)@130W 15sec破砕×15sec休止×2回(1min) | |
| 17.試薬の溶解(コルチゾールデキサメサゾン等難水溶性の試薬)。 ルチゾールの水への溶解 | (1) 15mlﾁｭｰﾌﾞ | (1) 12.5mlにHydrocortisolを0.4mg加えて溶解（10e-4mol） | (1) @200W 6sec破砕×6sec休止×12回(2.4min) | (1) 溶解し変性もなかった。 |
