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セルバイオラボ社 レンチウイルスによる遺伝子デリバリー

記事ID : 6975

3. レンチウイルスの力価測定


使用するキット

● QuickTiter™ Lentivirus Titer Kit(品番:VPK-107)

【構成内容】

  • ViraBind™ Lentivirus Reagent A(100X)
  • ViraBind™ Lentivirus Reagent B(100X)
  • Sample Diluent
  • Anti-p24 Antibody Coated Plate
  • FITC-Conjugated Anti-p24 Monoclonal Antibody
  • HRP-Conjugated Anti-FITC Monoclonal Antibody
  • Assay Diluent
  • 10X Wash Buffer
  • Substrate Solution
  • Stop Solution
  • Recombinant p24 Standard

プロトコール

I:スタンダードカーブの調製

  1. 下記の通りスタンダードカーブを作成します。
  2. p24 stock solution をサンプル希釈液で溶解し,ボルテックスにより良く溶かして37℃で30分間インキュベートします。
 Standard Tubes  Recombinant p24 Standard(μL)  Sample Diluent(μL)  p24(ng/mL)
1 10 990 100
2 500 of Tube #1 500 50
3 500 of Tube #2 500 25
4 500 of Tube #3 500 12.5
5 500 of Tube #4 500 6.25
6 500 of Tube #5 500 3.125
7 500 of Tube #6 500 1.5625
8 0 500 0

II:レンチウイルスサンプルの調製と不活化

  1. (オプション)レンチウイルス上清を新しい培養培地に溶かし,1mL になるように調節します。ネガティブコントロールとして,培養培地のみのものも使用します。
    ※サンプルが不明の場合,それぞれのサンプルの希釈液を数種類作成することを推奨します。
  2. 10μL のViraBindTM Lentivirus Reagent A を加え,ゆっくりと混合し,すぐに10μL のViraBindTM Lentivirus Reagent B を加えます。
    37℃で30 分間インキュベートします。
  3. 12,000 rpm で5分間遠心し,上清を注意深く取り除きます。ペレットを250μL のサンプル希釈液で懸濁し,ボルテックスでよく混合します。ウイルスを不活化するために,37℃で30分間インキュベートします。

III:アッセイ方法

  1. 使用する前に全ての試薬をプロトコールにそって,準備してください。
  2. それぞれのレンチウイルスサンプル,HIV p24 スタンダード,ブランク,コントロールをduplicate でアッセイします。
  3. 100μL の不活化したレンチウイルスサンプルとp24 抗原スタンダードを抗p24 抗体でコートされたプレートに加えます。
  4. プレートカバーでカバーし,37℃で少なくとも4 時間以上,または4℃で一晩インキュベートします。
  5. カバーおよび,空ウェルを外します。マイクロウェルストリップを3回250μl の洗浄バッファーで洗浄します。(それぞれの洗浄ステップでは, ウェルから洗浄液をアスピレーションによって取り除いてください)
    最後の洗浄で,ウェルを空にし,パットまたはペーパータオル上でタッピングして残りの洗浄バッファーを取り除いてください。
  6. 100μL の希釈した FITC 標識 Anti-p24 モノクローナル抗体を加えます。
  7. プレートカバーでカバーし,orbital shake を用いて室温で1時間インキュベートします。
  8. プレートカバーを外し,ストリップを3回Step 5 と同様に洗浄します。
  9. 100μL の希釈した HRP 標識Anti-FITC を加えます。
  10. プレートカバーでカバーし,orbital shake を用いて室温で1時間インキュベートします。
  11. プレートカバーを外し,ストリップを3回Step 5 と同様に洗浄後,すぐに次のステップに進んでください。
  12. 基質を室温に戻し,100μl をブランクを含む全てのウェルに加えます。orbital shake を用いて室温で1時間インキュベートします。実際には, 2-30分間の場合もあります。
    ※プレートを注意深く観察し,色がすぐに変化した場合,すぐに反応を止める必要があります。
  13. ブランクを含む全てのウェルに 100μl の停止液を加えて酵素反応を止め,450nm で測定します。
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