3. レンチウイルスの力価測定

● QuickTiter™ Lentivirus Titer Kit（品番：VPK-107）

【構成内容】

• ViraBind™ Lentivirus Reagent A（100X）
• ViraBind™ Lentivirus Reagent B（100X）
• Sample Diluent
• Anti-p24 Antibody Coated Plate
• FITC-Conjugated Anti-p24 Monoclonal Antibody
• HRP-Conjugated Anti-FITC Monoclonal Antibody
• Assay Diluent
• 10X Wash Buffer
• Substrate Solution
• Stop Solution
• Recombinant p24 Standard

I：スタンダードカーブの調製

1. 下記の通りスタンダードカーブを作成します。
2. p24 stock solution をサンプル希釈液で溶解し，ボルテックスにより良く溶かして37℃で30分間インキュベートします。

II：レンチウイルスサンプルの調製と不活化

1. （オプション）レンチウイルス上清を新しい培養培地に溶かし，1mL になるように調節します。ネガティブコントロールとして，培養培地のみのものも使用します。
   ※サンプルが不明の場合，それぞれのサンプルの希釈液を数種類作成することを推奨します。
2. 10μL のViraBindTM Lentivirus Reagent A を加え，ゆっくりと混合し，すぐに10μL のViraBindTM Lentivirus Reagent B を加えます。
   37℃で30 分間インキュベートします。
3. 12,000 rpm で5分間遠心し，上清を注意深く取り除きます。ペレットを250μL のサンプル希釈液で懸濁し，ボルテックスでよく混合します。ウイルスを不活化するために，37℃で30分間インキュベートします。

III：アッセイ方法

1. 使用する前に全ての試薬をプロトコールにそって，準備してください。
2. それぞれのレンチウイルスサンプル，HIV p24 スタンダード，ブランク，コントロールをduplicate でアッセイします。
3. 100μL の不活化したレンチウイルスサンプルとp24 抗原スタンダードを抗p24 抗体でコートされたプレートに加えます。
4. プレートカバーでカバーし，37℃で少なくとも4 時間以上，または4℃で一晩インキュベートします。
5. カバーおよび，空ウェルを外します。マイクロウェルストリップを3回250μl の洗浄バッファーで洗浄します。（それぞれの洗浄ステップでは， ウェルから洗浄液をアスピレーションによって取り除いてください）
   最後の洗浄で，ウェルを空にし，パットまたはペーパータオル上でタッピングして残りの洗浄バッファーを取り除いてください。
6. 100μL の希釈した FITC 標識 Anti-p24 モノクローナル抗体を加えます。
7. プレートカバーでカバーし，orbital shake を用いて室温で1時間インキュベートします。
8. プレートカバーを外し，ストリップを3回Step 5 と同様に洗浄します。
9. 100μL の希釈した HRP 標識Anti-FITC を加えます。
10. プレートカバーでカバーし，orbital shake を用いて室温で1時間インキュベートします。
11. プレートカバーを外し，ストリップを3回Step 5 と同様に洗浄後，すぐに次のステップに進んでください。
12. 基質を室温に戻し，100μl をブランクを含む全てのウェルに加えます。orbital shake を用いて室温で1時間インキュベートします。実際には， 2-30分間の場合もあります。
    ※プレートを注意深く観察し，色がすぐに変化した場合，すぐに反応を止める必要があります。
13. ブランクを含む全てのウェルに 100μl の停止液を加えて酵素反応を止め，450nm で測定します。