セルバイオラボ社 レンチウイルスによる遺伝子デリバリー プロトコール内で使用した商品
技術情報
セルバイオラボ社 レンチウイルスによる遺伝子デリバリー
レンチウイルス発現のしくみ
使用するキットおよび試薬
● ViraSafe™ miRNA Lentiviral Expression System, Ecotropic （品番#VPK-220-ECO）
【キット構成品】
- pSMPUW-miR-GFP/Puro レンチウイルス クローニング/ 発現ベクター （品番：VPK-220）
- pRSV-Rev パッケージングベクター
- pCMV-Eco エンベロープベクター
- pCgpV パッケージングベクター
- pSMPUW-LacZ コントロールベクター
<< キットに含まれないもの>>
- 293T細胞 （メーカー推奨：293LTV 細胞（品番LTV-100））
- 細胞培養培地
・トランスフェクション試薬
プロトコール
I ： miRNA precursor のクローニング
※ miRNA precursor のクローニングのための設計方法はp.102 ページをご参考ください
図1： pSMPUW-miR-GFP-Puro ベクター
II : トランスフェクション・レンチウイルスの産生
- 目的遺伝子をレンチウイルスベクターにクローニングします。miRNA precursor のクローニング方法はセルバイオラボ社 アデノウイルスによる遺伝子デリバリー（1. リコンビナントアデノウイルスの作製）をご参照下さい。
※または，キットに含まれるpSMPUW-LacZ コントロールベクターをコントロール実験用に使用します。 - トランスフェクションの1 日前に293T細胞または293LTV細胞をプレートに70-80％コンフルになるように培養します。
- リン酸カルシウムまたは他のトランスフェクション試薬を用いてトランスフェクションを開始します。
※細胞へのトランスフェクションは，FuGENE® Transfection reagent やLipofectamine™ Plus などの試薬をご使用いただけます。
※推奨混合比； pSMPUW：pCMV-Eco：pRSV-Rev：pCgpV ＝ 3：1：1：1 - トランスフェクション後36-72時間，レトロウイルスウイルス上清を培養します 12時間毎に2-3回上清を採取し，それぞれ4℃で保存します。
- 集めた上清をプールし，1,500rpm で5分間遠心し，細胞の残渣を取り除き，0.22μm フィルターを通します。
- 上清はそのまま精製 / 濃縮に使用します。長期間保存する場合は，分注して-80℃に保存してください。
