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総説：植物ウイルス病害診断

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宮崎大学農学部植物生産環境科学科教授

竹下　稔先生

はじめに

植物病理学は植物を病虫害や雑草害などから保護すること（植物保護、植物防疫）に関連する学問領域に含まれます。植物は生涯にわたり、常に病原体による攻撃リスクにさらされており、特に農作物は栽培者による保護管理を必須としています。農業生産現場における植物病害の防除の重要なステップとして、病害発生時における迅速かつ的確な病害診断が挙げられます。

ここでは様々な病原体と宿主植物に関する植物病害診断技術の中から植物ウイルス病害に関する数種の診断技術について紹介します。

植物ウイルス病害の診断の現状

植物ウイルス病害防除の基盤となる診断技術は概して生物検定、血清学的診断、遺伝子診断に分けられます^1）。

まず、生物検定は病害発生現場や採取試料が移送された試験研究機関等における病徴診断、試料・画像保存から始まります。現場とウイルス診断の場所が遠距離の場合、初期診断として画像診断も行われます。電子顕微鏡を備えている施設では試料中に含まれる粒子形態の直接観察も可能です。罹病植物や発病時期、圃場の環境条件などを総合的に判断し、感染が疑われるウイルス種の想定のもと、各種判定植物を用いた人の手による展開葉への摩擦接種、接ぎ木接種、および虫媒による接種試験を行います。

生物検定の際に、単一病斑を形成できる局部感染植物が確認された場合、病斑部を切り抜いて、局部感染植物を用いた汁液接種試験を繰り返し、ウイルス分離株を確立します。その後、ウイルス分離株を用いて各種判別植物における接種試験を行います。生物検定とほぼ並行して血清学的診断や遺伝子診断が行われます。植物ウイルス病害の診断の際に注意すべき点として、仮に同じ植物種とウイルス種の組み合わせであっても、症状は時間の経過とともに変化していくこと、植物の感染部位、感染時期、感染後の経過日数などによって、ウイルスの拡散や濃度にかなりの差異が生じること等が挙げられます。

植物ウイルスの血清学的診断法

血清学的診断としては、マイクロタイタープレートを用いるEnzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）法（図1）^2）、特異的抗体を用いたイムノクロマトグラフィー法（図2）やニトロセルロースメンブレンを用いるTissueimmunoblotting 法^3）、4）、Dot immunobinding assay（DIBA）法^5）などが挙げられます。

間接ELISA 法では罹病感染組織を緩衝液で摩砕後、摩砕液上清を適宜希釈して、プレートの各試料溝に入れ、ウイルス抗原を底に吸着させます。試料液の洗浄後、一次抗体として検出対象となる植物ウイルスの外被タンパク質等を特異的に認識する抗体を加えます。一次抗体は必要に応じて健全植物由来の摩砕液成分により、事前に非特異的反応を抑制するための抗体吸収反応を行います。これは、抗体作製の際に利用する純化ウイルス標品に微量の植物由来成分が含まれている際に有効です。一定時間の抗原- 抗体反応後、洗浄により未反応の一次抗体を除去します。続いて、二次抗体として酵素結合抗ウサギ抗体を加え、一次抗体と二次抗体の反応を一定時間行います。反応液を洗浄して未反応の二次抗体を除去後、基質を加え、基質液の変色の程度を数値化して、陽性・陰性を判断します。

イムノクロマト法ではストリップを試料液に浸した後、抗原が含まれる試料液が上方に移動し、植物ウイルス特異的抗体との抗原抗体反応が起こると陽性を示す線が現れます。結果が陽性の場合、テストラインとコントロールラインと呼ばれる2 本の線が現れます。陰性の場合、コントロールラインのみ検出されます。試料液を浸した後、15 分程度で結果が判明します。この手法は栽培現場で簡易的に利用できます。

Tissue immunoblotting 法では植物組織をスタンプのようにニトロセルロースメンブレンに押し付けた後、またDIBA 法では摩砕汁液をニトロセルロースメンブレンに染み込ませた後にELISA 法と基本的に同じステップを経て、最後は酵素反応により水に不溶性の色素を生成する基質によって検出を行います。

図1　間接ELISA法による植物ウイルス病害診断の概略

図2　イムノクロマト法による植物病害診断の概略

植物ウイルスの遺伝子診断法

遺伝子診断法としては、標的ウイルス遺伝子特異的PCRプライマーを用いた従来からのRT-PCR 法に加え、リアルタイムPCR 法（図3）やLoop-Mediated IsothermalAmplification（LAMP）法の利用場面が徐々に拡がっています。近年、植物ウイルスの遺伝子診断でも利用可能なモバイルタイプのリアルタイムPCR 装置も開発されてきており、農業生産現場での迅速・高感度診断をこれまで以上に意識した診断技術の開発が進められています。

海外からの農作物の輸入により国内未発生の植物病原ウイルスの侵入にも警戒する必要があります。その場合、遺伝子データベースを活用して標的ウイルス遺伝子特異的PCR プライマーを作製し、遺伝子診断の準備をしておく必要があります。しかしながら、未報告の植物病原ウイルス種や既報であっても変異の度合いが大きいウイルス系統が現れた場合は遺伝子診断から漏れることも想定されます。そのようなリスクに対応するため、次世代シーケンサーを利用して網羅的にウイルス遺伝子を検出するケースも増えてきています6）。これは、植物ウイルス感染による症状が疑われながらも、従来のRT-PCR 法では検出されない試料を診断する場合、あるいは感染ウイルス種を全て検出したい場合の有効な検定手段となります。

次世代シーケンス用の核酸試料として、植物から抽出したウイルスゲノムRNA 由来の2 本鎖RNAを調製する場合があります。ウイルスゲノムRNA 由来の2 本鎖RNA の利用には植物由来の様々なRNA 種によるバックグランドを低減する効果が期待されます。次世代シーケンスの結果、ウイルス由来の核酸配列が検出された場合、その遺伝子情報をもとに新たにPCR プライマーを設計し、RT-PCR 法やリアルタイムPCR 法による検出で再確認することになります。

図3　リアルタイムPCR法におる植物ウイルス病害診断の概略

今後の展望

従来は診断に必要な装置・設備が整った空間での診断業務が主流でしたが、それに加えて、現場で利用できる迅速・簡易・高感度、そして網羅的植物ウイルス診断法の開発ニーズがより一層高まってくることも予想されます。今後、世界的な農産物の輸出入ネットワークの拡大に伴い、国外で甚大な被害をもたらしている重要病原植物ウイルスに対する検疫強化の重要性も徐々に高まると考えています。また、地球規模の気候変動による病害虫の分布域の拡大による国内未発生の植物病原ウイルスの国内侵入・発生を予測し、予め植物ウイルス病害の診断体制を確立しておくことも必要になるでしょう。

参考文献

1) 大木　理. 植物ウイルス同定の基礎. 社団法人　日本植物防疫協会　(2009)
2) Maneechoat P, Takeshita M, Uenoyama M, Nakatsukasa M, Kuroda A, Furuya N and Tsuchiya K. A single amino acid at N-terminal region of the 2b protein ofcucumber mosaic virus strain m1 has a pivotal role in virus attenuation. VirusResearch 197, 67-74. (2015)
3) Khanig YY, Yudai Kobayashi, Y and Takeshita, M. The 2b protein and C-terminalregion of the 2a protein indispensably facilitate systemic movement ofcucumber mosaic virus in radish with supplementary function by either the 3aor the coat protein. Virology Journal 17, 49 (2020)
4) Takeshita M, Suzuki M, Kuwata S, Takanami Y. Involvement of cucumbermosaic cucumovirus RNA2 and RNA3 in viral systemic spread in radish plant.Archives of Virology 143, 1109-1117. (1998)
5) 櫛間義幸　改良 DIBA（Dot Immuno-Binding Assay）法を用いたキュウリウイルス病の簡便かつ低コスト診断法. 九州病害虫研究会報 63, 1-7 (2017)
6) Hayahi S, Ota E, Kurogi S, Matsushita Y, Kanno Y and Takeshita M. A nextgeneration-sequencing approach to diagnose viral diseases of greenhouseranunculus. Journal of General Plant Pathology 88, 134-137. (2022)