RNA-Seqのサンプル調製に、バクテリア用リボソームRNA除去キットRiboCop rRNA Depletion Kit for Bacteria

Total RNAには多量のリボソームRNA（rRNA）が含まれ、細菌サンプルから抽出したtotal RNAでは、リボソームRNAは最大で全体の98%を占めます。Lexogen 社RiboCop rRNA Depletion Kitは、分解の進んだtotal RNAやインタクトなtotal RNAからリボソームRNAを効率良く除去します。リボソームRNA除去後のRNAは、次世代シークエンス解析を含む各種RNA解析にご使用いただけます。

• ヒト、マウス、ラット用 リボソームRNA除去キット

• 細菌サンプルより、リボソームRNA（23S, 16S, 5S rRNA）を効率良く除去
• 細菌群（mixed bacterial samples）用、グラム陰性菌用、グラム陽性菌用のキットをご用意
• 磁気ビーズを用いた簡単な精製プロトコル
• 所要時間は1.5時間（作業時間は30分）
• Total RNA 量1 ng 〜 1,000 ng（1 μg）に対応
• インタクトなRNA、分解の進んだRNA のいずれにも対応

プローブとターゲット配列のアクセス向上のため、アフィニティプローブとtotal RNAを混ぜて変性させます。その後、昇温によりRNAとプローブをハイブリダイゼーションします。この間、ハイブリダイズしたRNAを除去するために使用する除去ビーズを調製します。残ったRNAを磁気ビーズを用いて精製し、終了です。精製に磁気ビーズを用いる事でプロトコルをオートメーション化し、また容易で短時間のプロトコルとなっています。

図1. RiboCop rRNA Depletion Kitのワークフロー

幅広いインプット量に対応

E. coliから精製したtotal RNAについて、RiboCop rRNA Depletion Kit for Gram Negative Bacteria（G-）を用いてリボソームRNAを除去した（インプット量 1 ng‐1 ug ）。リボソームRNA除去後、リボソームRNAに由来するリードは全体の98%から1-3%に減少した（図2）。また、その後のトランスクリプトーム解析ではリボソームRNA除去による影響は見られなかった（図3）。

図2. E. coli RNAにおけるリボソームRNA除去効率
E. coliから精製したtotal RNA（1, 10, 100 ng, 1 μg）について、RiboCop rRNA Depletion Kit for Gram Negative Bacteria（G-）を用いてリボソームRNAを除去し、total RNAと並行して、Lexogen社のCORALL Total RNA-Seq Library Prep Kitを用いてNGSライブラリーを作製した。Illumina NextSeq（1×75 bp）でシークエンス解析し、BBMapを用いてMG1655株のリファレンス配列にマッピングした。リボソームRNAにマッピングされたリードを青色で示した。

図3. トランスクリプトーム解析結果の相関（E. coli total RNA vs. リボソームRNA除去後のE. coli RNA）
E. coli から精製したtotal RNA（1, 10, 100 ng, 1 μg）について、RiboCop rRNA Depletion Kit for Gram Negative Bacteria（G-）を用いてリボソームRNAを除去し、total RNAと並行して、Lexogen社のCORALL Total RNA-Seq Library Prep Kitを用いてNGSライブラリーを作製した。Illumina NextSeq（1×75 bp）でシークエンス解析し、STARを用いてMG1655株のリファレンス配列にマッピング、FeatureCountsを用いてリードをカウントした。

メタトランスクリプトーム解析におすすめ

糞便から抽出した細菌RNAについて、RiboCop rRNA Depletion Kit for Mixed Bacterial Samples（META）を用いてリボソームRNAを除去し、メタトランスクリプトーム解析を行った（表1）。
また、本キットは、インプット量100 ngまで単一の細菌からもリボソームRNAを効率良く除去可能で（図4）、その後のトランスクリプトーム解析ではリボソームRNA除去による影響は見られなかった（図5）。

図4. 単一細菌RNAにおけるリボソームRNA除去効率
単一細菌から精製したtotal RNA（10, 100 ng）について、RiboCop rRNA Depletion Kit for Mixed Bacterial Samples (META)を用いてリボソームRNAを除去し、total RNAと並行して、Lexogen社のCORALL Total RNA-Seq Library Prep Kitを用いてNGSライブラリーを作製した。Illumina NextSeq（1×75 bp）でシークエンス解析し、E. coli MG1655, P. aeruginosa PAO1, B. subtilis 168のリファレンス配列にマッピングした。リボソームRNAにマッピングされたリードを青色で示した。

図5. トランスクリプトーム解析結果の相関（単一細菌 total RNA vs. リボソームRNA除去後の単一細菌RNA）
単一細菌から精製したtotal RNA（100 ng）について、RiboCop rRNA Depletion Kit for Mixed Bacterial Samples（META）を用いてリボソームRNAを除去し、total RNAと並行して、Lexogen社のCORALL Total RNA-Seq Library Prep Kitを用いてNGSライブラリーを作製した。Illumina NextSeq（1×75 bp）でシークエンス解析し、E. coli MG1655, P. aeruginosa PAO1, B. subtilis 168のリファレンス配列にマッピングした。

高い再現性、低いオフターゲット

RiboCop rRNA Depletion Kitは高い再現性でリボソームRNAを除去可能で、反復したトランスクリプトーム解析では、細菌種や使用するプローブミックスに依らず、結果に高い相関が見られた（図6）。
図3では幅広いインプット量で、図5では様々な単一細菌を用いて、未処理のtotal RNAとトランスクリプトーム解析結果を比較した。何れも外れ値がなく、高い相関性が見られ、RiboCop rRNA Depletion Kitではオフターゲット作用を抑えながらリボソームRNAを除去できることを示した。

図6. RiboCop rRNA Depletion Kitの再現性
10ngのtotal RNAからRiboCop rRNA Depletion Kit for Gram Negative Bacteria（G-）または RiboCop rRNA Depletion Kit for Gram Positive Bacteria（G+）を用いてリボソームRNAを除去する操作を独立して2回行った。Lexogen社のCORALL Total RNA-Seq Library Prep Kitを用いてNGSライブラリーを作製、Illumina NextSeq（1×75 bp）でシークエンス解析し、E. coli MG1655, P. aeruginosa PAO1, B. subtilis 168のリファレンス配列にマッピングした。

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