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記事ID : 36812
研究用

RNA-Seqのサンプル調製に、バクテリア用リボソームRNA除去キットRiboCop rRNA Depletion Kit for Bacteria

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Total RNAには多量のリボソームRNA(rRNA)が含まれ、細菌サンプルから抽出したtotal RNAでは、リボソームRNAは最大で全体の98%を占めます。Lexogen 社RiboCop rRNA Depletion Kitは、分解の進んだtotal RNAやインタクトなtotal RNAからリボソームRNAを効率良く除去します。リボソームRNA除去後のRNAは、次世代シークエンス解析を含む各種RNA解析にご使用いただけます。

特長

  • 細菌サンプルより、リボソームRNA(23S, 16S, 5S rRNA)を効率良く除去
  • 細菌群(mixed bacterial samples)用、グラム陰性菌用、グラム陽性菌用のキットをご用意
  • 磁気ビーズを用いた簡単な精製プロトコル
  • 所要時間は1.5時間(作業時間は30分)
  • Total RNA 量1 ng 〜 1,000 ng(1 μg)に対応
  • インタクトなRNA、分解の進んだRNA のいずれにも対応

ワークフロー

プローブとターゲット配列のアクセス向上のため、アフィニティプローブとtotal RNAを混ぜて変性させます。その後、昇温によりRNAとプローブをハイブリダイゼーションします。この間、ハイブリダイズしたRNAを除去するために使用する除去ビーズを調製します。残ったRNAを磁気ビーズを用いて精製し、終了です。精製に磁気ビーズを用いる事でプロトコルをオートメーション化し、また容易で短時間のプロトコルとなっています。

RiboCop rRNA Depletion Kitのワークフロー
図1. RiboCop rRNA Depletion Kitのワークフロー

パフォーマンス

幅広いインプット量に対応

E. coliから精製したtotal RNAについて、RiboCop rRNA Depletion Kit for Gram Negative Bacteria(G-)を用いてリボソームRNAを除去した(インプット量 1 ng‐1 ug )。リボソームRNA除去後、リボソームRNAに由来するリードは全体の98%から1-3%に減少した(図2)。また、その後のトランスクリプトーム解析ではリボソームRNA除去による影響は見られなかった(図3)。

E. coli RNAにおけるリボソームRNA除去効率
図2. E. coli RNAにおけるリボソームRNA除去効率
E. coliから精製したtotal RNA(1, 10, 100 ng, 1 μg)について、RiboCop rRNA Depletion Kit for Gram Negative Bacteria(G-)を用いてリボソームRNAを除去し、total RNAと並行して、Lexogen社のCORALL Total RNA-Seq Library Prep Kitを用いてNGSライブラリーを作製した。Illumina NextSeq(1×75 bp)でシークエンス解析し、BBMapを用いてMG1655株のリファレンス配列にマッピングした。リボソームRNAにマッピングされたリードを青色で示した。

トランスクリプトーム解析結果の相関
図3. トランスクリプトーム解析結果の相関(E. coli total RNA vs. リボソームRNA除去後のE. coli RNA)
E. coli から精製したtotal RNA(1, 10, 100 ng, 1 μg)について、RiboCop rRNA Depletion Kit for Gram Negative Bacteria(G-)を用いてリボソームRNAを除去し、total RNAと並行して、Lexogen社のCORALL Total RNA-Seq Library Prep Kitを用いてNGSライブラリーを作製した。Illumina NextSeq(1×75 bp)でシークエンス解析し、STARを用いてMG1655株のリファレンス配列にマッピング、FeatureCountsを用いてリードをカウントした。

メタトランスクリプトーム解析におすすめ

糞便から抽出した細菌RNAについて、RiboCop rRNA Depletion Kit for Mixed Bacterial Samples(META)を用いてリボソームRNAを除去し、メタトランスクリプトーム解析を行った(表1)。
また、本キットは、インプット量100 ngまで単一の細菌からもリボソームRNAを効率良く除去可能で(図4)、その後のトランスクリプトーム解析ではリボソームRNA除去による影響は見られなかった(図5)。

表1. 糞便から抽出した細菌RNAにおけるリボソームRNA除去効率
糞便から抽出した細菌RNAについて、RiboCop rRNA Depletion Kit for Mixed Bacterial Samples(META)を用いてリボソームRNAを除去し、NGSライブラリーを作製、シークエンス解析を行った。リードは〜60アノテーションにマップされた。
Sample % rRNA reads
stool microbiome 10 ng 14.75(± 1.4)
stool microbiome 100 ng 15.32(± 1.4)
stool microbiome 1 μg 23.37(± 1.6)

単一細菌RNAにおけるリボソームRNA除去効率

図4. 単一細菌RNAにおけるリボソームRNA除去効率
単一細菌から精製したtotal RNA(10, 100 ng)について、RiboCop rRNA Depletion Kit for Mixed Bacterial Samples (META)を用いてリボソームRNAを除去し、total RNAと並行して、Lexogen社のCORALL Total RNA-Seq Library Prep Kitを用いてNGSライブラリーを作製した。Illumina NextSeq(1×75 bp)でシークエンス解析し、E. coli MG1655, P. aeruginosa PAO1, B. subtilis 168のリファレンス配列にマッピングした。リボソームRNAにマッピングされたリードを青色で示した。

トランスクリプトーム解析結果の相関
図5. トランスクリプトーム解析結果の相関(単一細菌 total RNA vs. リボソームRNA除去後の単一細菌RNA)
単一細菌から精製したtotal RNA(100 ng)について、RiboCop rRNA Depletion Kit for Mixed Bacterial Samples(META)を用いてリボソームRNAを除去し、total RNAと並行して、Lexogen社のCORALL Total RNA-Seq Library Prep Kitを用いてNGSライブラリーを作製した。Illumina NextSeq(1×75 bp)でシークエンス解析し、E. coli MG1655, P. aeruginosa PAO1, B. subtilis 168のリファレンス配列にマッピングした。

高い再現性、低いオフターゲット

RiboCop rRNA Depletion Kitは高い再現性でリボソームRNAを除去可能で、反復したトランスクリプトーム解析では、細菌種や使用するプローブミックスに依らず、結果に高い相関が見られた(図6)。
図3では幅広いインプット量で、図5では様々な単一細菌を用いて、未処理のtotal RNAとトランスクリプトーム解析結果を比較した。何れも外れ値がなく、高い相関性が見られ、RiboCop rRNA Depletion Kitではオフターゲット作用を抑えながらリボソームRNAを除去できることを示した。

RiboCop rRNA Depletion Kitの再現性
図6. RiboCop rRNA Depletion Kitの再現性
10ngのtotal RNAからRiboCop rRNA Depletion Kit for Gram Negative Bacteria(G-)または RiboCop rRNA Depletion Kit for Gram Positive Bacteria(G+)を用いてリボソームRNAを除去する操作を独立して2回行った。Lexogen社のCORALL Total RNA-Seq Library Prep Kitを用いてNGSライブラリーを作製、Illumina NextSeq(1×75 bp)でシークエンス解析し、E. coli MG1655, P. aeruginosa PAO1, B. subtilis 168のリファレンス配列にマッピングした。

細菌群(mixed bacterial samples)用リボソームRNA除去キット

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
RiboCop rRNA Depletion Kit for Mixed Bacterial Samples (META), 24 preps詳細データ LEX 125.24 24 PREP.
¥219,000
RiboCop rRNA Depletion Kit for Mixed Bacterial Samples (META), 96 preps詳細データ LEX 125.96 96 PREP.
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グラム陰性菌用リボソームRNA除去キット

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
RiboCop rRNA Depletion Kit for Gram Negative Bacteria (G-), 24 preps詳細データ LEX 126.24 24 PREP.
¥159,000
RiboCop rRNA Depletion Kit for Gram Negative Bacteria (G-), 96 preps詳細データ LEX 126.96 96 PREP.
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グラム陽性菌用リボソームRNA除去キット

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
RiboCop rRNA Depletion Kit for Gram Positive Bacteria (G+), 24 preps詳細データ LEX 127.24 24 PREP.
¥159,000
RiboCop rRNA Depletion Kit for Gram Positive Bacteria (G+), 96 preps詳細データ LEX 127.96 96 PREP.
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商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

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