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記事ID : 36812
研究用

RNA-Seqのサンプル調製に、バクテリア用リボソームRNA除去キット RiboCop rRNA Depletion Kit for Bacteria

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Total RNAには多量のリボソームRNA(rRNA)が含まれ、細菌サンプルから抽出したtotal RNAでは、リボソームRNAは最大で全体の98%を占めます。Lexogen 社RiboCop rRNA Depletion Kitは、分解の進んだtotal RNAやインタクトなtotal RNAからリボソームRNAを効率良く除去します。リボソームRNA除去後のRNAは、次世代シークエンス解析を含む各種RNA解析にご使用いただけます。

特長

  • 細菌サンプルより、リボソームRNA(23S, 16S, 5S rRNA)を効率良く除去
  • 細菌群(mixed bacterial samples)用、グラム陰性菌用、グラム陽性菌用のキットをご用意
  • 磁気ビーズを用いた簡単な精製プロトコル
  • 所要時間は1.5時間(作業時間は30分)
  • Total RNA 量1 ng 〜 1,000 ng(1 μg)に対応
  • インタクトなRNA、分解の進んだRNA のいずれにも対応

ワークフロー

プローブとターゲット配列のアクセス向上のため、アフィニティプローブとtotal RNAを混ぜて変性させます。その後、昇温によりRNAとプローブをハイブリダイゼーションします。この間、ハイブリダイズしたRNAを除去するために使用する除去ビーズを調製します。残ったRNAを磁気ビーズを用いて精製し、終了です。精製に磁気ビーズを用いる事でプロトコルをオートメーション化し、また容易で短時間のプロトコルとなっています。

RiboCop rRNA Depletion Kitのワークフロー
図1. RiboCop rRNA Depletion Kitのワークフロー

パフォーマンス

幅広いインプット量に対応

E. coliから精製したtotal RNAについて、RiboCop rRNA Depletion Kit for Gram Negative Bacteria(G-)を用いてリボソームRNAを除去した(インプット量 1 ng‐1 ug )。リボソームRNA除去後、リボソームRNAに由来するリードは全体の98%から1-3%に減少した(図2)。また、その後のトランスクリプトーム解析ではリボソームRNA除去による影響は見られなかった(図3)。

E. coli RNAにおけるリボソームRNA除去効率
図2. E. coli RNAにおけるリボソームRNA除去効率
E. coliから精製したtotal RNA(1, 10, 100 ng, 1 μg)について、RiboCop rRNA Depletion Kit for Gram Negative Bacteria(G-)を用いてリボソームRNAを除去し、total RNAと並行して、Lexogen社のCORALL Total RNA-Seq Library Prep Kitを用いてNGSライブラリーを作製した。Illumina NextSeq(1×75 bp)でシークエンス解析し、BBMapを用いてMG1655株のリファレンス配列にマッピングした。リボソームRNAにマッピングされたリードを青色で示した。

トランスクリプトーム解析結果の相関
図3. トランスクリプトーム解析結果の相関(E. coli total RNA vs. リボソームRNA除去後のE. coli RNA)
E. coli から精製したtotal RNA(1, 10, 100 ng, 1 μg)について、RiboCop rRNA Depletion Kit for Gram Negative Bacteria(G-)を用いてリボソームRNAを除去し、total RNAと並行して、Lexogen社のCORALL Total RNA-Seq Library Prep Kitを用いてNGSライブラリーを作製した。Illumina NextSeq(1×75 bp)でシークエンス解析し、STARを用いてMG1655株のリファレンス配列にマッピング、FeatureCountsを用いてリードをカウントした。

メタトランスクリプトーム解析におすすめ

糞便から抽出した細菌RNAについて、RiboCop rRNA Depletion Kit for Mixed Bacterial Samples(META)を用いてリボソームRNAを除去し、メタトランスクリプトーム解析を行った(表1)。
また、本キットは、インプット量100 ngまで単一の細菌からもリボソームRNAを効率良く除去可能で(図4)、その後のトランスクリプトーム解析ではリボソームRNA除去による影響は見られなかった(図5)。

表1. 糞便から抽出した細菌RNAにおけるリボソームRNA除去効率
糞便から抽出した細菌RNAについて、RiboCop rRNA Depletion Kit for Mixed Bacterial Samples(META)を用いてリボソームRNAを除去し、NGSライブラリーを作製、シークエンス解析を行った。リードは〜60アノテーションにマップされた。
Sample % rRNA reads
stool microbiome 10 ng 14.75(± 1.4)
stool microbiome 100 ng 15.32(± 1.4)
stool microbiome 1 μg 23.37(± 1.6)

単一細菌RNAにおけるリボソームRNA除去効率

図4. 単一細菌RNAにおけるリボソームRNA除去効率
単一細菌から精製したtotal RNA(10, 100 ng)について、RiboCop rRNA Depletion Kit for Mixed Bacterial Samples (META)を用いてリボソームRNAを除去し、total RNAと並行して、Lexogen社のCORALL Total RNA-Seq Library Prep Kitを用いてNGSライブラリーを作製した。Illumina NextSeq(1×75 bp)でシークエンス解析し、E. coli MG1655, P. aeruginosa PAO1, B. subtilis 168のリファレンス配列にマッピングした。リボソームRNAにマッピングされたリードを青色で示した。

トランスクリプトーム解析結果の相関
図5. トランスクリプトーム解析結果の相関(単一細菌 total RNA vs. リボソームRNA除去後の単一細菌RNA)
単一細菌から精製したtotal RNA(100 ng)について、RiboCop rRNA Depletion Kit for Mixed Bacterial Samples(META)を用いてリボソームRNAを除去し、total RNAと並行して、Lexogen社のCORALL Total RNA-Seq Library Prep Kitを用いてNGSライブラリーを作製した。Illumina NextSeq(1×75 bp)でシークエンス解析し、E. coli MG1655, P. aeruginosa PAO1, B. subtilis 168のリファレンス配列にマッピングした。

高い再現性、低いオフターゲット

RiboCop rRNA Depletion Kitは高い再現性でリボソームRNAを除去可能で、反復したトランスクリプトーム解析では、細菌種や使用するプローブミックスに依らず、結果に高い相関が見られた(図6)。
図3では幅広いインプット量で、図5では様々な単一細菌を用いて、未処理のtotal RNAとトランスクリプトーム解析結果を比較した。何れも外れ値がなく、高い相関性が見られ、RiboCop rRNA Depletion Kitではオフターゲット作用を抑えながらリボソームRNAを除去できることを示した。

RiboCop rRNA Depletion Kitの再現性
図6. RiboCop rRNA Depletion Kitの再現性
10ngのtotal RNAからRiboCop rRNA Depletion Kit for Gram Negative Bacteria(G-)または RiboCop rRNA Depletion Kit for Gram Positive Bacteria(G+)を用いてリボソームRNAを除去する操作を独立して2回行った。Lexogen社のCORALL Total RNA-Seq Library Prep Kitを用いてNGSライブラリーを作製、Illumina NextSeq(1×75 bp)でシークエンス解析し、E. coli MG1655, P. aeruginosa PAO1, B. subtilis 168のリファレンス配列にマッピングした。

細菌群(mixed bacterial samples)用リボソームRNA除去キット

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
RiboCop rRNA Depletion Kit for Mixed Bacterial Samples (META)詳細データ LEX 125.24 24 PREP.
¥316,000
RiboCop rRNA Depletion Kit for Mixed Bacterial Samples (META)詳細データ LEX 125.96 96 PREP.
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グラム陰性菌用リボソームRNA除去キット

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
RiboCop rRNA Depletion Kit for Gram Negative Bacteria (G-)詳細データ LEX 126.24 24 PREP.
¥285,000
RiboCop rRNA Depletion Kit for Gram Negative Bacteria (G-)詳細データ LEX 126.96 96 PREP.
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グラム陽性菌用リボソームRNA除去キット

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
RiboCop rRNA Depletion Kit for Gram Positive Bacteria (G+)詳細データ LEX 127.24 24 PREP.
¥285,000
RiboCop rRNA Depletion Kit for Gram Positive Bacteria (G+)詳細データ LEX 127.96 96 PREP.
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商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

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