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EY社 レクチンプロトコール

記事ID : 5182

プロトコールとトラブルシューティングガイド

2. 蛍光(FITC、TRITC、TexasRed®)標識レクチン

メーカー名: EY

表)吸収と蛍光波長
  吸収/励起率 最大蛍光波長
FITC 492nm 517nm
TRITC 554nm 570nm
Texas Red® 596nm 615nm

®Texas Red is a registered trademark of Molecular Probes, Inc.

組織切片

1. 組織切片を洗浄してブロッキングを行います。血清製品には糖タンパク質が含まれており、非特異的なバックグラウンドが高くなることがありますので、血清製品は使用しないでください。ブロッキング後、推奨するバッファーで軽く洗浄します。

2. 蛍光標識レクチンを適当なバッファーを用いて20-100 ug/ml の濃度に希釈します。

3. モイスチャーチャンバー内で30 分間、組織切片を蛍光標識レクチンと一緒にインキュベートしてください。

4. 組織切片をバッファーで5分間、3回洗浄してください。

5. 蛍光顕微鏡を用いて組織切片を観察してください。適したフィルターを用いてください。

(参考文献 M.Immbar et.al.,(1973).Intl.Journal of Cancer,12,93-99)

細胞懸濁液

1. 細胞を適当なバッファーで洗浄してください。

2. 遠心分離機で細胞を回収してください。

3. 蛍光標識レクチンを適当なバッファーを用いて100 ug/ml の濃度に希釈します。

4. 約1×106個の細胞を希釈した蛍光標識レクチン 1 ml と一緒に15分間 室温もしくは37°Cのウォーターバスでインキュベートしてください。

5. 遠心分離機を用いて細胞をバッファーで5分間、3回洗浄してください。

6. 蛍光顕微鏡を用いて細胞(固定あり、あるいはなしで)を観察してください。適したフィルターを用いてください。

(参考文献 K.Phiss. (1977).Experimental Pathology,14,S15)
蛍光色素は遮光してください。実際には暗い部屋でインキュベーションを行うか、アルミニウム箔などで覆ってください。

注意:以下の手順を行うことによってレクチン結合の阻害を防ぐことができる可能性がございます。
   A. 蛍光標識レクチンと一緒にインキュベーションする前に切片もしくは細胞をinhibitory carbohydrateと一緒に室温で30-60 分間プレインキュベートを行う。
   B. 切片もしくは細胞を加える前に希釈した蛍光標識レクチンとinhibitory carbohydrateを一緒に室温で30-60 分間プレインキュベートを行う。

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