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EY社 レクチンプロトコール

記事ID : 5183

プロトコールとトラブルシューティングガイド

3. アルカリフォスファターゼ標識レクチン

メーカー名: EY

組織化学染色・ウエスタンブロット染色・ドットブロット染色

1. 組織片もしくはブロットを洗浄し、ブロッキングします。精製された牛血清アルブミン(BSA)かスキムミルクを、非特異的な結合を防ぐためのブロッキングに使用することをお勧めします。非特異的バックグランドが高くなる可能性があるので、糖タンパク質を含む血清製品は使用しないで下さい。

2. アルカリフォスファターゼ標識のレクチンを、推奨バッファーで1-20 ug/mlの濃度に希釈します。切片もしくはブロットを室温、湿室で30-90分間インキュベートします。インキュベートを2-8°Cで行う場合は、やや 長めのインキュベート時間が必要です。推奨バッファーで5分間、3回洗浄して下さい。

3. 説明書に従い、Dye/Substrateで発色操作を行ってください。

注意:下記手順のいずれかを操作を行うことによって、レクチン結合の阻害を防ぐことができる可能性があります。
   A. 手順2へ進む前に、切片もしくはブロットを、inhibitory carbohydrateと共に室温で30-60分間インキュベートする。
   B. 切片もしくはブロットをアプライする前に、希釈したアルカリフォスファターゼ標識のレクチンを、inhibitory carbohydrateと共に室温で30-60分間プレインキュベートする。

トラブルシューティングガイド
問題 原因 対処法
染色が薄い、
もしくは
染色されない
1. サンプル上の特異的糖鎖の濃度が低い 1-4の場合
a. インキュベート時間を増やしてください
b. (ブロット上の)サンプル、標識レクチン、もしくはDye/Substrateの濃度を増やしてください
2. 標識レクチンの濃度が低い
3. Dye/Substrateの濃度が低い
4. インキュベーション時間が足りない
5. 標識前のサンプル処理が不適当 a. 切片もしくはブロットを、異なるブロッキング試薬で処理してください
バックグラウンドが高い 1. 標識レクチン、もしくはDye/Substrateが濃すぎる a. 各試薬の濃度を減らしてください
b. インキュベート時間を減らしてください
2. 洗浄が不十分 a. 洗浄回数と洗浄時間を増やしてください
3. ブロッキングが不十分 a. 切片もしくはブロットを、異なるブロッキング試薬で処理してください
4. サンプルに酵素活性がある a. Dye/Substrate非存在下でバックグランド染色を起こすような活性が、サンプルにあるかどうかを測定してください
予想外の染色パターンになった 多数の原因 a. コントロール実験を行ってください
b. 証明もしくは反証のために、他の細胞化学法を用いてください
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