技術情報

記事ID ： 5186

プロトコールとトラブルシューティングガイド
6. ペルオキシダーゼ（HRP）酵素活性の分析

メーカー名： EY

化学的原理

ペルオキシダーゼ + H₂O₂ → 複合体
複合体 + AH₂ (供与体) → ペルオキシダーゼ + H₂O + A (colored)

分析用試薬

バッファー：	0.01 M リン酸ナトリウム, pH 6.0
酵素：	バッファーで希釈。使用可能希釈範囲：1-2 µg/ml
染料：	1% o-dianisidine（in methanol）を用事調製。注釈：固体は難溶性です。簡単にボルテックスし、使用前に沈殿させます。褐色ビンかアルミホイルで覆って保存します。
基質：	脱イオン水もしくは蒸留水で、0.3 % H₂O₂溶液を調製。使用前に、最終濃度が0.003 %になるように、バッファーで希釈します。

1.　基質6.0 mlに0.05 mlの染料を加え、ボルテックスします。この反応溶液を、反応用チューブとコントロール用チューブに2.9 mlずつ加えます。

2.　0タイムは、反応用チューブに希釈済み酵素を100 µl、もしくはコントロール用チューブにPBSを100 µl添加した時です。その後、しっかりと混合します。

3.　15秒毎に3分間、OD 460を測定し記録するか、100 µlのアジ化ナトリウムを添加して反応を停止させ、3分後に終点を読みとります。

4.　この値を、1分間当たりの吸光度の変化率を決定するために用います。

活性1unitは、25°Cで1分間に1 µmolの過酸化物を分解する酵素量とします。H₂O₂のモル吸光係数は、11.3 x 10³ cm^-1です。