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EY社 レクチンプロトコール

記事ID : 5186

プロトコールとトラブルシューティングガイド

6. ペルオキシダーゼ(HRP)酵素活性の分析

メーカー名: EY

化学的原理

ペルオキシダーゼ + H2O2 → 複合体
複合体 + AH2 (供与体) → ペルオキシダーゼ + H2O + A (colored)

分析用試薬

バッファー: 0.01 M リン酸ナトリウム, pH 6.0
酵素: バッファーで希釈。使用可能希釈範囲:1-2 µg/ml
染料: 1% o-dianisidine(in methanol)を用事調製。注釈:固体は難溶性です。簡単にボルテックスし、使用前に沈殿させます。褐色ビンかアルミホイルで覆って保存します。
基質: 脱イオン水もしくは蒸留水で、0.3 % H2O2溶液を調製。使用前に、最終濃度が0.003 %になるように、バッファーで希釈します。

操作手順

1. 基質6.0 mlに0.05 mlの染料を加え、ボルテックスします。この反応溶液を、反応用チューブとコントロール用チューブに2.9 mlずつ加えます。

2. 0タイムは、反応用チューブに希釈済み酵素を100 µl、もしくはコントロール用チューブにPBSを100 µl添加した時です。その後、しっかりと混合します。

3. 15秒毎に3分間、OD 460を測定し記録するか、100 µlのアジ化ナトリウムを添加して反応を停止させ、3分後に終点を読みとります。

4. この値を、1分間当たりの吸光度の変化率を決定するために用います。

酵素活性の計算法

活性1unitは、25°Cで1分間に1 µmolの過酸化物を分解する酵素量とします。H2O2のモル吸光係数は、11.3 x 103 cm-1です。

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