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EY社 レクチンプロトコール

記事ID : 5184

プロトコールとトラブルシューティングガイド

4. ペルオキシダーゼ (HRP)標識レクチン

メーカー名:EY

標識レクチンと共にインキュベートする前に、内因性のペルオキシダーゼ活性をブロックする必要があります。0.6 %過酸化水素(in EtOH)と共に切片もしくはブロットを室温で20分間前処理します。ブロッキング後、推奨バッファーで軽くすすいで下さい。

1. 組織片もしくはブロットを洗浄、ブロックします。精製された牛血清アルブミン(BSA)か脱脂粉乳を、非特異的な結合を防ぐためのブロッキングに使用するこ とをお勧めします。非特異的バックグランドが高くなる可能性があるので、糖タンパク質を含む血清製品は使用しないで下さい。

2. HRP 標識のレクチンを、推奨バッファー(アジ化ナトリウム不含)で1-20 mg/mlの濃度に希釈します。切片もしくはブロットを室温、モイスチャーチャンバーで30-90分間インキュベートします。インキュベートを2-8°Cで行う場合は、やや 長めのインキュベート時間が必要です。推奨バッファーで各5分間、3回すすいで下さい。

3. 説明書に従って、Dye/Substrateを用いて発色操作を行ってください。

注意:下記手順のいずれかの操作を行うことによって、レクチン結合の阻害を防ぐことができる可能性があります。
   A. 手順3へ進む前に、レクチン処理した切片もしくはブロットを、inhibitory carbohydrateと共に室温で30-60分間インキュベートする。
   B. 切片もしくはブロットをアプライする前に、希釈したHRP標識のレクチンを、inhibitory carbohydrateと共に室温で30-60分間プレインキュベートする。

トラブルシューティングガイド
問題 原因 対処法
染色がうすい、もしくは染色されない 1. サンプル上の特異的オリゴ糖の濃度が低い 1-4の場合
a. インキュベート時間を増やしてください
b. (ブロット上の)サンプル、標識レクチン、もしくはDye/Substrateの濃度を増やしてください
2. 標識レクチンの濃度が低い
3. Dye/Dubstrateの濃度が低い
4. インキュベーション時間が足りない
5. 標識前のサンプル処理が不適当 a. 切片もしくはブロットを、異なるブロッキング試薬で処理してください
バックグラウンドが高い 1. 標識レクチンと、もしくはDye/Substrateが濃すぎる a. 各試薬の濃度を減らしてください
b. インキュベート時間を減らしてください
2. 洗浄が不十分 a. 洗浄回数と洗浄時間を増やしてください
3. ブロッキングが不十分 a. 切片もしくはブロットを、異なるブロッキング試薬で処理してください
4. サンプルに酵素活性がある a. Dye/Substrate非存在下でバックグランド染色を起こすような活性が、サンプルにあるかどうかを測定してください
予想外の染色パターンになった 多数の原因 a. コントロール実験を行ってください
b. 証明もしくは反証のために、他の細胞化学法を用いてください
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