安定化した蛍光アクチンフィラメントは、ミオシンモータータンパク質研究で用いられるin vitroのアクチン運動アッセイ（in vitro actin motility assays）の優れた基質です［1］。Acti-stain™ 488ファロイジンは、 in vitroでのミオシンATPaseのアクチン活性化には影響しません。
技術情報
Cytoskeleton（CYT）社 ファロイジン‐アクチン染色プロトコール
記事ID ： 13093
2. in vitro でのF-アクチン標識〜in vitro motility assays〜 (蛍光ファロイジン、アクチンタンパク質を使用)
■ 試薬
- Actin protein (250 μg, #AKL99-A)
- アクチン用バッファー (5 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.2 mM CaCl2; #BSA01)
- 10x アクチン重合用バッファー (500 mM KCl, 20 mM MgCl2, 10 mM ATP; #BSA02)
- Acti-stain™ 488 ファロイジン (#PHDG1-A)
■ 機器
- 蛍光顕微鏡
励起フィルター：450-480±20 nm，吸収フィルター：535±20nm (FITC filter block) - デジタルCCDカメラ
プロトコル-概略-
- rabbit muscle actin（#AKL99-A）を250 μlのアクチン用バッファーで0.2 mM ATP および1.0 mM DTTを添加し、1 mg/mlに再懸濁します。 よく混合し、氷上に1時間置きます。
- 1/10量の重合バッファーを添加し、室温で1時間インキュベートすることで、重合させます。
- 70nM Acti-stain™ 488 ファロイジンを含む1x重合バッファー(500μlの重合バッファーに14 μM ファロイジンストック溶液2.5 μlを添加して作製）で重合アクチンフィラメントを100倍希釈します。
- 1μlの標識アクチンをスライド上の退色防止剤入り封入剤に滴下します。
- 封入剤にカバースリップを置き、余分な溶液はふき取ります。
- 顕微鏡観察によって、蛍光フィラメントを観察します。観察できるアクチンフィラメントは、平均長2-10 μmであり、4℃・暗所で1週間安定です。
- 特集ページはこちら ファロイジン‐アクチン染色（Phalloidin / Actin）とは
参考文献
Wulf F, Deboben A, Bautz FA, Fualstich H, and Wieland TH. 1979. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. PNAS USA71, 4498-4502.［PMID：291981］
商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては
使用しないように、十分ご注意ください。
