細胞が機能する生体内細胞環境をより正確に再現し、細胞の形態や機能が細胞を閉じ込める細胞外環境にどのように反応するかを研究するために、細胞や組織切片は3Dコラーゲンマトリックスで培養されます。蛍光ファロイジン染色で F-アクチン細胞骨格の完全性と構造 (およびそれが受けるあらゆる変化) を忠実に捉えるには、細胞/切片の適切な固定と取り扱いが必要です。ファロイジン染色用の細胞の固定にはメタノールは避け、代わりに、アクチンフィラメントの染色に優れ、ラメリポディアの保存状態も良好なパラホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドを使用する必要があります。
技術情報
Cytoskeleton（CYT）社 ファロイジン‐アクチン染色プロトコール
■ 試薬
- セミコンフルエントな3D組織培養細胞または組織切片（これらの培養の準備については、以下の補足詳細を参照してください。）
- Acti-stain 488 ファロイジン (＃PHDG1-A)
その他、Acti-stain 535 (＃PHDR1)、Acti-stain 555 (＃PHDH1-A)、Acti-stain 670 (＃PHDN1-A) があります。 - F-アクチン染色キット (＃BK005) または 下記試薬
- 固定液 (3.7% パラホルムアルデヒド in PBS, pH to 7.0 が必要です。)
- 膜透過バッファー (0.5 % Triton X-100 in PBS)
- 退色防止剤入り封入剤 (Fluka BioChemika, # 10981)
- カバーガラスシーリング液（透明なマニキュア）
■ 機器
- 蛍光顕微鏡
【Acti-stain™ 488 の場合】 FITC励起フィルター：450-480 ± 20 nm，吸収フィルター ：535 ± 20 nm
【Acti-stain™ 535 と 555 の場合】 励起フィルター：535 ± 20 nm，吸収フィルター ：585 ± 20 nm
【Acti-stain™ 670 の場合】 励起フィルター：630 ± 20 nm，吸収フィルター ：680 ± 20 nm - デジタルCCDカメラ
プロトコル-概略-
- 製造元の指示に従ってファロイジンを再構成します。指示に従ってPBS で希釈し、ワーキング溶液を作製します。作製した溶液は、室温・暗所で保存します。
- コラーゲンゲル中の細胞を3.7% (v/v) パラホルムアルデヒドで室温で10分間固定します。
- PBSで3回洗浄します。
- 細胞を0.1 -0.5% (v/v) Triton X-100で室温で10分間透過処理します。
- PBSで3回洗浄します。
- コラーゲンゲルを約1 mm3のサンプルに切ります。
- 0.165 µM Acti-stain ファロイジンで、室温で暗所で 30 分間染色します。
注: この濃度は経験的に決定する必要がある場合があります。 必要に応じて、ファロイジンと併用して100 nM DAPI in PBS で細胞核を染色できます。 - PBSで3回洗浄します。
- 染色したサンプルをスライドガラス上に置き、光による退色を防ぐため、退色防止剤入り封入剤を一滴垂らし、ガラスカバースリップで軽く押します。
- 可能であれば、カバースリップの端をマニキュアでシーリングします。
- すぐに観察するか、スライドを暗所で 4°C に最大 24 時間保存します。
- 適切な蛍光顕微鏡セットアップを使用して、染色したサンプルの細胞を視覚化します。例えば、63倍の油浸レンズを備えた共焦点蛍光顕微鏡を、適切なフィルター（励起・発光）の設定で使用します。
- 3D ゲル染色を分析する場合、各サンプルから5 - 10個の代表的な最大投影Zスタックを収集すると、各画像内の細胞の平均輝度を決定するのに役立ちます。
- 特集ページはこちら ファロイジン‐アクチン染色（Phalloidin / Actin）とは
商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては
使用しないように、十分ご注意ください。
